乳酸杆菌噬菌体的分离鉴定及不同理化因素对发酵过程的影响

摘要

乳酸菌已被广泛应用于乳、肉、蔬菜和饲料等发酵工业，但噬菌体污染普遍存在，引起发酵过程减慢、周期延长以及产量和质量下降，导致发酵失败，并造成严重的经济损失。本研究利用乳制品、泡菜分离噬菌体，对其主要生物学特性及不同理化因素对发酵过程的影响进行分析，为保护工业菌株、控制发酵生产中噬菌体污染，并制定有效防控措施提供实验数据和理论依据。
　　采用斑点实验及双层琼脂平板法，分别以L.casei ATCC393、L.pentosus KLDS1.0413、L.brevis ATCC367为指示菌，从乳制品及泡菜中分离获得三株烈性乳杆菌噬菌体:一株L.caseiATCC393菌株的烈性噬菌体，命名为Lc;一株L.pentosus KLDS1.0413菌株的烈性噬菌体，命名为Lpen;一株L.brevis ATCC367菌株的烈性噬菌体，命名为Lbre。分别对三株烈性噬菌体的生物学特性进行鉴定，电镜观察结果显示，噬菌体Lc、Lpen均由多面体头部和非收缩性尾部组成，而噬菌体Lbre由多面体头部和收缩性尾部组成，根据形态学分析，Lc和Lpen属于Siphoviridae科，B1类，Lbre属于Myoviridae科，A1类。对3株噬菌体提取基因组，经限制性内切酶作用后，核酸电泳结果表明，噬菌体Lc、Lpen基因组均为异质平末端，其包装机制属满头包装，即pac-型，而Lbre含有粘性末端，其包装机制属于cos-型。噬菌体Lc、Lbre宿主专一，Lpen宿主谱较广。一步生长曲线显示，噬菌体Lc潜伏期和裂解期分别为60 min和45 min，裂解量为47 PFU/cell;Lpen潜伏期为45 min，裂解期为90 min，裂解量为30 PFU/cell; Lbre潜伏期为150 min，裂解期为105 min，裂解量为24 PFU/cell。
　　通过分析外界环境中的理化因素对噬菌体的影响，结果表明:噬菌体对外界环境温度(-20℃、0℃、20℃、32℃、37℃、42℃)敏感性较差，随着温度升高，噬菌体活性略有降低。不同浓度乙醇和异丙醇对噬菌体表现出不同的抗性，25％乙醇处理40 min，噬菌体Lc被灭活;35％乙醇处理30 min，Lpen被灭活;10％乙醇处理10 min，噬菌体Lbre被灭活。25％异丙醇处理20 min噬菌体Lc被灭活，25％异丙醇处理50 min噬菌体Lpen被灭活，25％异丙醇处理20 min噬菌体Lbre被灭活。常用消毒剂0.05％新洁尔灭、0.05％ KMnO4及0.1％甲醛处理噬菌体Lc、Lpen及Lbre，5 min后均被灭活。紫外线照射1h，噬菌体Lc、Lpen及Lbre效价均可下降2-4个数量级，有效抑制了噬菌体的活性。
　　通过对发酵介质中不同理化因素对噬菌体及宿主菌的影响分析，结果表明，噬菌体对高温较敏感，56℃处理噬菌体Lc、Lpen及Lbre，分别于20 min、45 min及10 min后全部灭活;噬菌体对酸、碱有较强的耐受性，在pH=3-12范围内噬菌体活性相对稳定，宿主菌在pH=4-9范围内活性相对稳定。对二价阳离子Ca2+或Mg2+影响的检测结果表明，宿主菌在MCM、MRS-Ca、MRS-Mg、 MRS培养基中均能正常生长，而噬菌体Lc、Lpen、Lbre在未添加Ca2+或Mg2+条件下，效价下降了2-4个数量级。发酵介质添加T-20(0.1％、1％、2％)时，当T-20浓度增加到2％时，宿主菌仍可正常生长，噬菌体Lc效价下降3个数量级，噬菌体Lpen和Lbre可完全灭活。发酵介质添加不同浓度NaCl（1％、2％、3％和5％）时，宿主菌均能正常生长，当NaCl添加量为5％时，噬菌体Lc效价下降2个数量级，噬菌体Lpen可完全灭活，Lbre耐受性较强，不能被灭活。
　　本研究分离得到三株乳杆菌烈性噬菌体，对其主要生物学特性进行研究，并针对环境及发酵介质中的不同理化因素对发酵过程中的影响进行检测，为控制噬菌体侵染宿主菌、保护工业菌株、制定有效防治噬菌体污染的措施提供了理论依据，也为深入了解噬菌体与宿主菌间相互作用提供了重要的实验数据和参考。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1．2 乳杆菌的分类及功能作用

1．1．3 乳杆菌在发酵业中的应用

1．2 乳酸菌噬菌体研究概述

1．2．1 噬菌体简介

1．2．2 乳酸菌噬菌体的研究进展

1．3 乳杆菌噬菌体在发酵业中的危害及防治

1．3．1 噬菌体污染对发酵业的影响

1．3．2 噬菌体污染的来源

1．3．3 噬菌体污染的控制措施

1．4 研究目的与意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 样品和菌株

2．1．2 主要分子生物学试剂

2．1．3 主要实验仪器与设备

2．1．4 培养基配制

2．1．5 主要溶液配制

2．2 试验方法

2．2．1 乳酸菌噬菌体的分离

2．2．2 噬菌体生物学特性的测定

2．2．3 环境中不同理化因素对噬菌体的影响

2．2．4 发酵介质中不同理化因素对发酵过程的影响

3 结果

3．1 乳杆菌噬菌体的分离及生物学特性的研究结果

3．1．1 噬菌体的分离结果

3．1．2 噬菌体的形态观察结果

3．1．3 噬菌体的宿主范围鉴定结果

3．1．4 最佳感染复数的测定结果

3．1．5 一步生长曲线的测定结果

3．1．6 噬菌体限制性酶切图谱分析结果

3．1．7 噬菌体结构蛋白的SDS-PAGE分析

3．2 环境中不同理化因素对噬菌体的影响结果

3．2．1 温度对噬菌体的影响结果

3．2．2 紫外线对噬菌体的影响结果

3．2．3 消毒剂对噬菌体的影响结果

3．3 发酵介质中不同理化因素对发酵过程的影响结果

3．3．1 不同pH对宿主菌和噬菌体的影响结果

3．3．2 温度对宿主菌和噬菌体的影响结果

3．3．3 二价阳离子对宿主菌和噬菌体的影响结果

3．3．4 NaCl对噬菌体和宿主菌的影响结果

3．3．5 T-20对噬菌体和宿主菌的影响结果

4 讨论

4．1 三株噬菌体分离株的生物学特性分析

4．2 如何利用理化因素有效控制环境中的噬菌体

4．3 理化因素对发酵介质中宿主菌和噬菌体的影响分析

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文