马鹿茸降血糖肽的制备及性质研究

摘要

鹿茸是雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，主要含有氨基酸、总磷脂、脂肪酸、糖类、激素样物质、硫酸软骨素、多胺、肽类、维生素、酶类以及碱基类物质等，其中氨基酸成分占总成分的一半以上。鹿茸中的蛋白质主要是以角蛋白、胶原蛋白、胰岛素样生长因子和表皮成长因子等形式存在，具有提高机体的免疫功能和抗氧化能力，能够促进组织创伤的愈合，降血糖等生理作用。
　　为了研究鹿茸多肽的降血糖活性及构效关系，为鹿茸生物活性肽的开发和利用创造条件，本文以马鹿茸为原料，确定马鹿茸降血糖肽的制备工艺条件、对马鹿茸降血糖肽进行分离纯化、对分离组分进行体外降血糖效果验证并对多肽的结构进行分析。具体研究内容和实验结果如下:
　　(1)马鹿茸降血糖肽制备研究:采用双酶法以马鹿茸为原料制备降血糖肽。从Alcalase、Flavourzyme、中性蛋白酶和胰蛋白酶四种酶中筛选出其酶解产物对α-葡萄糖苷酶抑制率高的两种酶，分别为Alcalase和Flavourzyme，并根据其体外降血糖效果确定酶的作用顺序为Alcalase-Flavourzyme，通过单因素实验和正交实验确定双酶酶解适宜工艺条件为先用Alcalase在pH8.0，60℃，底物浓度为12％，加酶量为5000U/g条件下酶解3h，再用Flavourzyme于pH6.5，45℃，底物浓度为5％，加酶量为6000U/g条件下酶解1h。双酶分步水解终产物的α-葡萄糖苷酶抑制率受质量浓度的影响，当质量浓度为3mg/mL时，α-葡萄糖苷酶抑制率可达94.09％，IC50值为1.82mg/mL。
　　(2)马鹿茸降血糖肽分离纯化研究:采用超滤技术对马鹿茸降血糖肽进行富集，将收集的小分子多肽通过Sephadex LH-20葡聚糖凝胶色谱进行分离纯化，在加样量1.5mL、加样浓度55mg/mL、洗脱流速0.25mL/min的条件下，马鹿茸降血糖肽可分离得到四个组分，分别为PⅠ、PⅡ、PⅢ、PⅣ。
　　(3)马鹿茸降血糖肽体外降血糖功能研究:建立HepG2细胞胰岛素抵抗模型，确定最适胰岛素浓度为10-7mmol/L;研究马鹿茸降血糖肽纯化组分对HepG2细胞的影响，其中组分PⅢ(0.05mg/mL)的葡萄糖消耗量最高，其对细胞存活率的影响高于阳性对照;为了更全面的研究马鹿茸降血糖肽纯化组分的体外降血糖功能，选取大鼠胰岛β细胞株RIN-m5F来验证体外降血糖功能，高剂量的组分PⅢ对细胞的增殖作用接近于阳性对照（Exendin-4），其对经STZ（链脲佐菌素）损伤的胰岛β细胞的细胞增殖率高于其他组分(PⅠ、PⅡ、PⅣ)，接近于阳性对照组的效果。
　　(4)马鹿茸降血糖肽分子量测定及氨基酸序列分析:将超滤后的马鹿茸降血糖肽通过Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳法分析，结果发现有4条清晰的条带，分子量分布在3.3kDa～7.8kDa之间。利用纳升级液相色谱(nano-HPLC-M S/MS)分析出马鹿茸降血糖肽纯化组分PⅢ中共有多肽308条，其中置信度大于90％的多肽有15条，分子量分布在420.46Da至749.4Da之间。

目录

摘要

1 绪论

1．1 鹿茸的概述

1．2 鹿茸活性成分国内外研究现状

1．3 鹿茸活性多肽的研究现状

1．3．1 活性多肽的简介

1．3．2 鹿茸活性多肽的功能介绍

1．3．3 鹿茸活性多肽的研究进展

1．4 鹿茸生物活性肽制备、分离纯化及分析方法

1．4．1 鹿茸活性多肽的制备方法

1．4．2 鹿茸活性多肽的分离纯化方法

1．4．3 鹿茸活性多肽的分析方法

1．5 研究的目的及意义

1．6 研究的主要内容

2 双酶法制备马鹿茸降血糖肽研究

2．1 引言

2．2 材料与仪器

2．2．1 材料

2．2．2 仪器和设备

2．3 实验方法

2．3．1 马鹿茸冻干粉的制备

2．3．2 蛋白酶酶活力测定

2．3．3 蛋白酶的选择方法

2．3．4 双酶水解实验

2．3．5 水解度测定

2．3．6 蛋白质回收率测定

2．3．8 数据处理

2．4 结果与分析

2．4．1 蛋白酶酶活力测定结果

2．4．2 马鹿茸总肽键数htot值的确定

2．4．3 蛋白酶的选择

2．4．4 酶解顺序的测定

2．4．5 双酶水解实验

2．4．6 双酶水解正交实验

2．4．7 不同浓度双酶酶解终产物对α-葡萄糖苷酶抑制率的影响结果

2．5 本章小结

3 马鹿茸降血糖肽的分离纯化研究

3．1 引言

3．2 材料与仪器

3．2．1 材料

3．2．2 仪器和设备

3．3 实验方法

3．3．1 马鹿茸降血糖肽超滤

3．3．2 马鹿茸降血糖肽凝胶色谱分离

3．3．3 数据处理

3．4 结果与分析

3．4．1 超滤工艺参数对膜通量的影响

3．4．2 超滤离心管的清洗

3．4．3 超滤后两组分对α-葡萄糖苷酶抑制率的影响

3．4．4 超滤后小分子多肽的紫外最大吸收波长的测定

3．4．5 Sephadex LH-20凝胶色谱分离条件优化

3．5 本章小结

4 马鹿茸降血糖肽对HepG2细胞和RINm5F细胞影响的研究

4．1 引言

4．2 材料与仪器

4．2．1 材料

4．2．2 仪器和设备

4．3 实验方法

4．3．1 细胞复苏

4．3．2 细胞培养

4．3．3 HepG2细胞胰岛素抵抗模型的建立

4．3．4 HepG2细胞的葡萄糖消耗作用及细胞增殖作用

4．3．5 胰岛β细胞增殖作用

4．4．2 HepG2细胞的葡萄糖消耗及细胞增殖作用

4．4．3 胰岛β细胞增殖作用

4．4．4 STZ损伤的胰岛β细胞修复作用

4．5 本章小结

5 马鹿茸降血糖肽分子量测定及氨基酸序列分析

5．1 引言

5．2 材料与仪器

5．2．1 材料

5．2．2 仪器和设备

5．3 实验方法

5．3．1 Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳

5．3．2 马鹿茸降血糖肽纯化组分PⅢ的氨基酸序列测定

5．4 结果与分析

5．4．2 马鹿茸降血糖肽纯化组分PⅢ的氨基酸序列

5．5 本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

声明