苦荞总黄酮的纯化与芦丁水溶性粉体的研究

摘要

本文以苦荞种子为原料，采用乙醇浸提法获得60.56％的粗黄酮。为了提高总黄酮的含量，本实验中利用反溶剂重结晶方法将总黄酮进一步纯化，并对其表征、溶解度、体外释放规律、小肠吸收和细胞抗氧化性进行了考察。该实验和结果如下:用Design Expert8.0软件，按Box-Behnken设计对该工艺进行优化，得到以下最佳条件:搅拌时间13.9min，总黄酮浓度70.0mg/mL，再结晶温度38.0℃，水（反溶剂）与甲醇（溶剂）的体积比为10∶1。在此条件下，总黄酮的得率和纯度分别为94.35％和99.81％，其中芦丁的含量为86.37％，山奈酚-3-O-芸香糖苷的含量为3.61％，槲皮素的含量为5.21％。通过粒径和SEM对纯化后的黄酮进行表征，结果表明反溶剂法不仅提高了总黄酮的纯度，还减小了黄酮的粒径的大小（250-430nm）。由于粒径的减小，总黄酮的溶解度、体外的释放速率和小肠吸收均有所提高，但细胞毒性实验结果表明，苦荞黄酮纯化微粉并没有因为吸收改善后对细胞产生毒性。在抗氧化方面，因为吸收度增加和生物相容性的提高，细胞抗氧化结果显示出经纯化后，苦荞黄酮的抗氧化能力提高。
　　本文利用上述纯化黄酮为原料，采用溶剂重结晶法，使芦丁通过在乙醇中重结晶来改变原有的晶体结构改善其水溶性和生物利用度。实验中，在60℃时芦丁在乙醇中完全溶解，放置于25℃时，由于过饱和析出新的晶体，即芦丁乙醇溶剂化物。首先为了确定化学结构的变化，通过高效液相色谱和气相色谱分别对芦丁-乙醇化物中芦丁和乙醇的含量进行了测试，实验数据显示，两种物质之间以摩尔比1∶1形成氢键。FTIR测试中，芦丁的特征峰发生变化，进一步证实所得晶体中乙醇的存在。其次为鉴定芦丁乙醇化物晶体结构的变化，实验通过显微镜、SEM、XRD和DSC对其进行表征。结果表明，芦丁乙醇化物是不同于芦丁原药的一种新型晶体，具有不同结构特征。溶解性试验结果表明，由于晶体结构的改变使芦丁乙醇化物具有更好的吸湿性，所以比芦丁的溶解速率更快。在大鼠实验中，芦丁乙醇化物的生物利用度是芦丁原药的1.67倍，这意味着芦丁溶剂化后提高了口服吸收的效率。此外，对芦丁乙醇化物晶体结构的稳定性进行了考察。结果证明，芦丁乙醇化物吸潮后，易再次与水结合形成水合物即芦丁三水合物，但干燥密封条件下保存，晶体结构将不会改变。说明此结构是异于芦丁三水合物的亚稳态晶体。
　　本文利用羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)为包合材料，结合反溶剂法制备了芦丁-羟丙基-β-环糊精包合物，对其体外表征、体内生物利用度和降糖作用进行了测试。实验和结果如下:首先，了解芦丁与羟丙基-β-环糊精相溶解平衡，确定芦丁与羟丙基-β-环糊精的摩尔比例为1∶1时，芦丁可以完全被包合。其次，采用反溶剂重结晶法与包合技术相结合的方法，以N，N-二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂，丙酮为反溶剂，对单因素芦丁浓度、包合时间、包合温度、重结晶温度、溶剂与反溶剂比对芦丁-羟丙基-β-环糊精包合物中芦丁的载药量和包合率的影响，并得到最优条件:芦丁的浓度为120mg/mL，包合时间为60min、包合温度为25℃、重结晶温度为0℃、溶剂与反溶剂比为1∶13。在最佳条件下进行验证实验，所得结果:包合物的载药量为28.93％±0.12％，包封率为90.02％±1.3％。实验中利用SEM、FTIR、XRD、1HNMR和DSC对包合物进行表征。
　　结果显示:芦丁与羟丙基-β-环糊精形成了包合物且以一种无定型态的形式存在。此外进行了溶剂残留、溶解度、体外溶出、生物利用度和体内降糖测试。实验结果显示，芦丁羟丙基-β-环糊精包合物中的DMF和丙酮的残留量分别为0.021％和0.025％，均符合人用药物注册技术要求国际协调会(ICH)要求的最低标准;在水溶性的测试结果中，芦丁羟丙基-β-环糊精包合物的溶解度及体外溶出速率都明显高于芦丁原药同时，芦丁羟丙基-β-环糊精包合物的口服生物利用度约为芦丁的2.24倍，经过包合后的芦丁，在生物利用度提高的基础上，降糖活性有所提高，血糖含量可降为8.6mmol/L。

目录

摘要

1 绪论

1．1 苦荞简介

1．2 苦荞提取物概况

1．3 苦荞黄酮主要成分

1．3．1 苦荞黄酮生理功能

1．4 苦荞黄酮提取纯化研究现状

1．5 反溶剂重结晶技术

1．5．1 反溶剂重结晶技术制备超微粉

1．5．2 反溶剂重结晶技术应用

1．6 芦丁综述

1．6．1 芦丁研究现状

1．6．2 芦丁的提取与纯化

1．6．3 芦丁的生物活性

1．6．4 芦丁生物利用度的改善

1．7 溶剂化物

1．7．1 溶剂化物研究现状

1．8 环糊精

1．9 课题的提出及意义

1．9．1 课题的提出

1．9．2 课题研究的意义

1．10．1 课题研究的内容

1．10．2 课题的技术路线

2 反溶剂重结晶法纯化苦荞黄酮

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 苦荞黄酮的提取

2．2．2 反溶剂重结晶法纯化苦荞黄酮

2．2．3 响应面法优化苦荞黄酮纯化

2．2．4 紫外测定总黄酮含量

2．2．5 HPLC测定黄酮成分

2．2．6 粒径大小测定

2．2．7 SEM检测

2．2．8 水溶性检测

2．2．9 体外肠吸收测定

2．2．10 细胞毒性测定

2．2．11 细胞抗氧化活性测定

2．3．1 总黄酮含量

2．3．2 黄酮类化合物的种类

2．3．3 响应面优化分析

2．3．4 苦荞黄酮纯化微粉粒径

2．3．5 SEM

2．3．6 溶解度与溶出速率

2．3．7 体外肠吸收

2．3．8 细胞毒性

2．3．9 细胞抗氧化分析

2．4 本章小结

3 芦丁-乙醇溶剂化物的制备、表征及评价

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验仪器

3．2 实验方法

3．2．1 芦丁乙醇化物的制备

3．2．2 芦丁含量的测定

3．2．3 乙醇含量测定

3．2．4 芦丁-乙醇化物的理化性质表征

3．2．5 加速稳定性检测

3．2．6 体外溶出测试

3．2．7 生物利用度

3．3 实验结果与分析

3．3．1 芦丁-乙醇化物的化学结构分析

3．3．2 芦丁-乙醇化物的晶体结构分析

3．3．3 加速稳定性分析

3．3．4 体外溶出速率分析

3．3．5 生物利用度评价

3．4 本章小结

4 芦丁羟丙基-β-环糊精包合物制备、表征及评价

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验仪器

4．2 实验方法

4．2．2 芦丁羟丙基-β-环糊精包合物反溶剂法的制备

4．2．3 载药量及饱和率的测定

4．2．4 包合物的表征

4．2．5 溶剂残留检测

4．2．6 溶解度的测定

4．2．7 体外溶出的测定

4．2．8 生物利用度评价

4．2．9 体内降糖测试

4．3 结果与分析

4．3．1 芦丁羟丙基-β-环糊精的相平衡测定

4．3．2 单因素结果分析

4．3．3 最佳条件验证

4．3．4 包合物表征及结果分析

4．3．5 溶剂残留结果分析

4．3．6 水溶性测试结果分析

4．3．7 生物利用度评价

4．3．8 降糖作用

4．4 本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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