BRD4及ALKBH5小分子抑制剂筛选平台的建立及其抑制剂的筛选和活性评价

摘要

染色质是DNA和组蛋白的高分子配合物，是人类基因组的骨架结构，实现真核生物的可遗传性。染色质结构和功能调控的重要机制是组蛋白的翻译后修饰，不同的修饰所引起的功能使染色质的结构和功能更加多样和复杂。 BRD是唯一的可以识别组蛋白乙酰化修饰的蛋白结构域，介导蛋白之间的相互作用，是一类由大约110个氨基酸组成的高度保守的蛋白。根据序列的相似性可以将含有BRD结构域的蛋白分为9个蛋白家族，这些家族中最大的也是研究最多的为BET家族，BET家族由四个组蛋白赖氨酸乙酰化识别蛋白BRD2，BRD3，BRD4和BRDT组成，BET家族的蛋白都在其N端含有两个BRD活性结构域，BD1 和 BD2，以及一个超出末端的ET 结构域，可以识别结合组蛋白H3和H4及非组蛋白类蛋白的赖氨酸乙酰化残基。BRD4是BRD蛋白家族BET中非常重要的一种蛋白质，其底物广泛，可以识别多种组蛋白赖氨酸的乙酰化修饰，H3K9ac，H3K27ac，H3K14ac和H4K5ac，H4K16ac等；也有许多非组蛋白底物，包括p-TEFb，细胞周期蛋白T1，BRD4也可以与JMJD6、细胞周期蛋白T1/T2、CDK9形成复合物发挥转录调节作用。此外，BRD4在氧化应激反应中也有一定功能，影响KEAP1/NRF2通路，BRD4也参与DNA损伤应答。在疾病的发生发展中，BRD4参与多种疾病的发生和发展过程，在多种肿瘤中异常表达，包括各种血液肿瘤如AML，MLL，多发性骨髓瘤，淋巴瘤，以及实体瘤如睾丸线癌，肺腺癌，前列腺癌，恶性胰腺癌，黑色素瘤，恶性胶质瘤等。BRD4的抑制剂可以用于多种疾病的研究和治疗，因此，BRD4作为药物靶点，其抑制剂的发现对肿瘤的预防和治疗具有重要意义。 此外，RNA的修饰在RNA翻译和剪切及其他生物功能中也具有重要作用，影响多种生物进程。6位N原子上的甲基化修饰（m6A）是RNA修饰中最普遍的一种修饰，m6A几乎影响RNA代谢的各个方面，包括RNA的剪接、核输出、翻译效率及稳定性，在精子发育、干细胞分化、代谢及肿瘤发生发展中也发挥着关键作用。ALKBH5是继FTO之后又一个被发现的RNA去甲基化酶，能特异性的去除RNA和单链DNA腺嘌呤6位N的甲基化修饰，和RNA的甲基转移酶共同调控着RNA的甲基化平衡。在功能上，ALKBH5敲除的转基因鼠中p53凋亡通路中相关基因表达发生改变，ALKBH5在神经胶质瘤干性细胞中高表达，沉默ALKBH5可以抑制肿瘤干细胞增殖，影响ALKBH5靶基因的表达。ALKBH5的晶体结构已经被解析出来，在此基础上进一步研究ALKBH5的小分子抑制剂将会推动对mRNA上m6A修饰的生物学功能的研究，同时还可以为相关疾病的药物设计提供重要依据。 本文中我们选择 BRD4的两个活性区域构建 pGEX4T-1-BRD4（BD1）和pGEX4T-1-BRD4（BD2）原核表达载体，利用原核表达系统及亲和层析纯化得到 BRD4（BD1）和 BRD4（BD2）重组蛋白，并合成乙酰化的组蛋白 H4 作为底物，利用HTRF方法分别对两个重组蛋白进行活性评价，并优化反应条件，利用阳性化合物 JQ1 对体系进行评价，成功建立了 BRD4 小分子抑制剂高通量筛选平台。 接着我们对一系列吡唑类化合物的BRD4抑制活性进行了评价，得到了活性较好的WS-722，稀释法验证了WS-722在分子水平上对BRD4的抑制作用是可逆的，并对其进行了细胞水平的机制研究，结果显示WS-722可以抑制白血病细胞增殖，抑制 BRD4 活性，下调其靶基因 c-Myc的表达，促进白血病细胞的分化，有较好的抗肿瘤活性，为以后此类新型BRD4抑制剂的发现及优化奠定了基础。 此外，在前期工作的基础之上，我们将已构建的原核表达载体pET28b-FDH和pMCSG19-ALKBH5利用原核表达系统及亲和层析纯化得到FDH和ALKBH5重组蛋白。分别基于 FDH 酶联荧光方法和基于抗体和微珠的AlphaScreen 方法成功构建了ALKBH5活性检测体系，进一步优化体系条件，并利用柠檬酸盐对体系进行评价，成功建立了ALKBH5小分子抑制剂高通量筛选平台，进而为后续ALKBH5的生物学功能研究及相关疾病的药物发现打下基础。

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