SM22α参与TNF-α诱导的血管平滑肌细胞炎症应答的机制

摘要

目的:内皮损伤诱导的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)炎症应答是血管损伤修复和内膜增生的主要病理基础。肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)在炎症应答,免疫应答,细胞增殖和凋亡过程中具有重要作用。TNF-α通过激活细胞内炎症相关的信号通路尤其是NF-κB通路而诱导细胞表达各种炎症标志物;在血管损伤局部浸润的炎性细胞,通过分泌TNF-α而诱导VSMC表型转化和增殖。
　　 SM22α是分化型VSMC特异表达的一种小分子蛋白,该蛋白的表达活性与VSMC表型状态密切相关。以往研究发现,在缺失SM22α的小鼠,颈动脉内皮剥脱诱导的血管损伤,表现为增强的氧化应激,伴有NF-κB激活及核转位和促炎基因表达活性的升高。本研究利用体外培养的VSMC,通过敲低和过表达技术,探讨SM22α在TNF-α诱导的炎症应答中的作用。
　　 方法:按贴块法分离培养 VSMC,取3～6代细胞进行实验;采用Western blot和免疫细胞荧光染色进行蛋白质表达和细胞定位分析;采用DHE(超氧化物阴离子荧光探针)荧光染色法观察细胞活性氧分子(reactive oxygen species,ROS)水平。
　　 结果:
　　 1、TNF-α诱导NF-κB核转位
　　 用不同浓度(0,5,10,20 ng/ml)TNF-α刺激培养的VSMC不同时间(0,10,20,30,60 min)后,观察对NF-κB核转位的影响。Westernblot结果显示,TNF-α可剂量依赖性激活NF-κB核转位,而且,10 ng/mlTNF-α处理细胞30 min时,NF-κB p65核转位活性达到峰值(p＜0.05),但总NF-κB p65水平没有明显变化。提示TNF-α可诱导VSMCs炎症应答。
　　 2、敲低SM22α增强TNF-α诱导的NF-κB核转位
　　 采用SM22α特异性小干扰RNA(siSM22α)转染VSMC,敲低内源性SM22α表达。Western bolt分析结果显示,转染siSM22α后,其SM22α的表达明显低于对照组(P＜0.05)。免疫荧光染色结果显示,给予TNF-α刺激或敲低SM22α后,NF-κB p65核转位活性明显升高;而且,敲低SM22α后再给予TNF-α刺激,NF-κB p65核转位活性升高更明显。提示敲低SM22α可促进TNF-α诱导的NF-κB核转位。
　　 3、敲低SM22α促进TNF-α诱导的IKK磷酸化
　　 Western blot显示,处于静止期的VSMCs,其细胞内IKK磷酸化水平很低。给予TNF-α刺激或者敲低SM22α后,均诱导IKK的磷酸化水平升高(P＜0.05)。而且,敲低SM22α后给予TNF-α刺激,与对照组和单独给予刺激组相比,IKK的磷酸化水平明显升高(P＜0.01)。
　　 4、敲低SM22α增强TNF-α诱导的VSMCs氧化应激
　　 采用DHE荧光染色法观察敲低SM22α对ROS的影响。结果显示,与对照组相比,TNF-α刺激后,ROS生成有所增加。值得注意的是,在单独敲除SM22α后,与对照组相比,VSMCs中ROS的生成也有一定程度的升高。在敲低SM22α后再给予TNF-α刺激,ROS的生成与对照组相比明显增强,与单独给予TNF-α刺激或单独敲低SM22α组相比亦有一定程度的增高。
　　 5、敲低SM22α增强TNF-α诱导的Akt途径的激活
　　 Western blot分析显示,与对照组相比,给予TNF-α刺激后,能够明显上调Akt的磷酸化水平;同样,在仅敲低SM22α的VSMC中,P-Akt的水平也明显高于对照组(P＜0.05)。敲低SM22α后再给予TNF-α刺激时,AKT磷酸化水平升高幅度明显大于对照组(P＜0.05)。
　　 6、过表达SM22α抑制TNF-α诱导的NF-κB p65核转位
　　 给予ATRA处理细胞,以上调SM22α表达;随后,再给予TNF-α刺激。Western blot分析结果显示,与单独TNF-α刺激相比,SM22α过表达能够抵消TNF-α诱导的NF-κB p65核转位。此外,利用pAd-SM22α腺病毒感染细胞,使外源性的SM22α过表达,然后给予TNF-α刺激,免疫荧光染色分析结果显示,过表达外源性SM22α后同样能够抑制TNF-α诱导的NF-κB p65核转位。结果表明,SM22α可在一定程度上抑制炎症刺激诱导的VSMC炎症应答。
　　 结论:
　　 1、TNF-α诱导VSMC NF-κB核转位活化;
　　 2、敲低SM22α增强TNF-α诱导的NF-κB p65核转位和Akt途径的激活,加剧VSMCs氧化应激反应;
　　 3、过表达SM22α能够抑制TNF-α诱导的NF-κB p65核转位。

目录

文摘

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材料与方法

结果

附图

讨论

结论

参考文献

综述 SM22α表达和功能调节及在疾病发生中的作用

致谢

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