SM22α参与血管平滑肌细胞衰老和血管老化的机制

摘要

血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell, VSMC）衰老是动脉粥样硬化和高血压等心血管疾病发生发展的诱因之一。衰老的 VSMC通过分泌致炎因子和血管重构相关因子促进血管重构和血管老化，其中，成骨样转化是伴随细胞衰老而出现的一种表型重构形式，后者是诱发血管硬化、组织器官退行性变和功能失调的重要因素。衰老的细胞具有生长停滞、细胞骨架僵硬、炎性因子分泌增多等特征性表现。平滑肌（smooth muscle, SM）22α蛋白是一种平滑肌特异性标志物，主要分布于成熟平滑肌细胞，其基本功能是调节细胞骨架形成。近年研究显示，在衰老细胞中 SM22α表达升高，SM22α的同源蛋白Scp1p敲除后可延长酵母细胞寿命。然而， SM22α与细胞衰老的因果关系和分子机制尚不清楚。
　　目的：
　　本研究以血管紧张素II（angiotensin II, Ang II）为诱导因素，通过建立VSMC衰老模型，试图从体内外证实SM22α在VSMC衰老和血管老化进程中的作用，并探讨其作用机制，以期为揭示衰老相关心血管疾病的发生机制提供研究证据。
　　方法：
　　利用Ang II（10-7 mol/L）慢性刺激VSMC（5天），获得VSMC应激衰老模型；利用连续传代的方法建立 VSMC复制衰老模型。用野生型和Sm22α基因敲除小鼠皮下植泵，持续灌注Ang II（1μg/kg/min）四周，复制高血压模型。通过敲低和过表达SM22α以观察其对VSMC衰老及相关调控通路蛋白表达和活性的影响。衰老相关标志物 SA-β-gal染色分析、Real-time PCR、Western blot、免疫荧光和免疫组化检测用于鉴定VSMC衰老；免疫共沉淀检测蛋白质相互作用。使用钙化培养基（含有2.5 mmol/L磷酸盐的低糖DMEM培养基）处理细胞，诱导VSMC钙化；用茜素红染色、钙离子含量测定以及钙化标志物检测进行表型鉴定。
　　结果：
　　1 SM22α促进Ang II诱导的VSMC衰老
　　1.1 Ang II诱导VSMC衰老过程中SM22α表达上调
　　为了确定SM22α在VSMC衰老过程中的作用，利用Ang II诱导建立VSMC衰老模型。Ang II持续刺激VSMC5天和7天后， SA-β-gal活性显著增强，衰老标志蛋白p53、p21和γ-H2AX表达增高，核增殖抗原PCNA表达下调，表明细胞进入生长停滞的衰老状态；Western blot结果显示，在此过程中，SM22α的表达显著上调，与细胞衰老进程具有平行关系。
　　1.2 SM22α促进Ang II诱导的VSMC衰老
　　为确定SM22α在VSMC衰老过程中表达增高的意义，分别利用小干扰RNA敲低和腺病毒载体过表达SM22α，观察其对VSMC衰老的影响。结果显示，敲低 SM22α表达可降低衰老标志物的表达水平和活性， SA-β-gal活性增高以及p53和p21表达明显低于对照组；而过表达SM22α则可促进Ang II诱导的SA-β-gal活性增高以及p53和p21表达增加。结果表明，SM22α对Ang II诱导的VSMC衰老具有促进作用。
　　1.3缺失SM22α可改善Ang II诱导的高血压和血管老化
　　为验证SM22α是否在体内也具有促进VSMC衰老的作用，通过皮下植入 Ang II微渗透泵复制高血压模型，观察模型小鼠血压变化以及与血管老化的关系。结果显示，Sm22α-/-小鼠血压升高幅度较野生型小鼠明显降低，并且其主动脉组织中p53和p21蛋白表达水平和SA-β-gal活性也低于野生型小鼠。进一步提示SM22α表达增加与VSMC衰老具有因果关系。
　　2 SM22α促进VSMC衰老的机制
　　2.1 SM22α抑制p53泛素化
　　前已证实， VSMC衰老过程中，SM22α与p53表达变化具有相同趋势。为确定二者之间是否具有内在因果关系，通过敲低和过表达SM22α，观察对p53表达的影响。结果表明，在Ang II诱导VSMC衰老过程中，无论是敲低还是过表达SM22α，对p53的mRNA水平都没有明显影响；但是，敲低SM22α可提高p53泛素化水平，而过表达SM22α则降低p53泛素化。提示SM22α可影响p53的泛素化修饰。
　　2.2 SM22α抑制Mdm-2与p53的相互作用
　　泛素化蛋白酶体途径是 p53降解的主要机制。为进一步揭示 SM22α调节p53泛素化的分子机制，利用免疫共沉淀的方法检测p53与其泛素连接酶Mdm-2结合是否受SM22α表达的影响。结果表明，在Ang II诱导VSMC衰老条件下，SM22α表达下调可促进Mdm-2与p53的结合，上调SM22α表达则抑制Mdm-2与p53的结合；用Mdm-2抑制剂nutlin-3预孵育VSMC可逆转SM22α表达下调导致的Mdm-2与p53相互作用，伴随p53泛素化水平降低和表达升高。上述结果表明，SM22α通过抑制Mdm-2与p53的相互作用进而抑制p53的泛素化降解。
　　2.3 SM22α抑制Akt-Mdm-2通路活化
　　为探究SM22α影响p53泛素化降解的上游信号通路，检测SM22α表达改变对 Akt-Mdm-2信号通路活化的影响。结果显示，在 Ang II诱导VSMC衰老条件下，敲低SM22α表达可促进Akt-Mdm-2激活，相反，过表达SM22α则抑制Akt-Mdm-2通路的激活；用PI3K/Akt抑制剂LY294002预孵育VSMC可消除敲低SM22α引发的Akt-Mdm-2激活效应。同样，在Sm22α基因敲除小鼠动脉组织中Akt和Mdm-2的磷酸化水平也显著高于野生型小鼠。结果表明， SM22α对 p53泛素化降解的调节是通过Akt-Mdm-2信号通路介导的，过量的SM22α具有稳定p53的作用。
　　3 VSMC衰老诱发血管钙化的初步研究
　　3.1 VSMC复制性衰老促进细胞钙化
　　为确定 VSMC衰老与血管钙化的关系，首先利用连续传代的方法建立细胞复制性衰老模型，再换用高磷酸盐钙化培养基诱导钙化。SA-β-gal衰老染色和衰老标志物检测表明，13代（P13）的VSMC表现出明显的衰老特征。茜素红染色和钙离子含量测定结果显示，与对照组相比，P13的VSMC钙离子沉积明显；钙化相关调控因子BMP-2，OPN和ALP的表达活性升高，表明衰老的VSMC发生成骨样转化。
　　3.2 VSMC应激性衰老与细胞钙化的关系
　　为确定VSMC应激诱导衰老与钙化的关系，利用Ang II诱导VSMC应激衰老，并诱导钙化。细胞钙化检测结果显示，发生应激性衰老的VSMC其钙离子沉积明显增多，钙化相关调控因子BMP-2，OPN和ALP的活性也明显高于未衰老的细胞。结果表明，应激性衰老同样可促进细胞钙化发生。
　　3.3敲低SM22α表达可抑制衰老相关钙化
　　基于前两部分的研究发现，敲低SM22α可抑制细胞衰老，进而分析其与细胞钙化的关系。结果显示，siSM22α和Sm22α-/-组VSMC钙离子沉积减少，钙化调控因子BMP-2表达下调和ALP的活性下降，与减弱的衰老表型相一致，间接证明VSMC衰老与细胞钙化的因果关系。
　　结论：
　　1细胞衰老过程中SM22α表达增加。
　　2过量的SM22α促进VSMC衰老和血管老化。
　　3 SM22α蓄积抑制衰老相关信号通路Akt-Mdm-2的活化，减少p53泛素化降解，提高p53稳定性。
　　4细胞衰老可促进VSMC成骨样转化。

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引言

第一部分SM22α促进Ang II诱导的血管平滑肌细胞衰老

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分SM22α促进Ang II诱导VSMC衰老的机制

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第三部分VSMC衰老诱发血管钙化的初步研究

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

结论

综述:血管细胞衰老与心血管疾病

致谢

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