黑糯米酒工艺优化及发酵过程代谢组学研究

摘要

传统酒曲大多以谷物为主要原料，自然接种微生物发酵，酒曲微生物种类繁多，杂菌污染严重，品质不稳定；现代酒曲大多是纯菌种酒曲，发酵成品酒风味较为单一，不能满足消费者需求。为解决这一关键问题，且赋予黑糯米酒更好的品质。本研究以人参、酸枣仁、牛蒡根、甘草、芡实等12味药食同源物质作为制曲基质，研究根霉接种量、基质水分含量、培曲时间和培曲温度对新基质曲糖化酶活力和液化酶活力的影响。以糖化酶活力为响应值，在单因素试验基础上，采用响应面Box-Behnken试验设计优化最佳制曲工艺；以最佳工艺条件制作的新基质曲发酵黑糯米酒，在单因素实验基础上设计正交试验，优化黑糯米酒最佳酿造工艺条件；采用代谢组学方法对黑糯米酒发酵72h内代谢物进行跟踪研究。研究结果如下： (1)新基质曲的最佳工艺条件为：根霉接种量0.3%、培曲时间40h、基质水分含量65%和培曲温度28℃，在此条件下糖化酶活力预测值为778.65mg/g.h。最佳培曲条件经过3次验证性试验，所得糖化酶活力实测平均值为779.233±0.577mg/g.h，实测值与预测值较为接近，说明此方案可行。新基质曲糖化酶和液化酶活力分别约为传统曲的1.3和2.8倍。对传统曲和新基质曲酿造米酒中的33种酒体成分进行检测，两种酒中差异最大的物质分别是异戊醇(10.065μg/100mL/109.394μg/100mL)、丁酸乙酯(0.867μg/100mL/187.552μg/100mL)、乙酸(135.240μg/100mL/560.939μg/100mL)、苯酚(0.156μg/100mL/0.858μg/100mL)。结果表明，新基质曲具有良好的发酵性能。 （2）黑糯米酒最佳酿造工艺条件为：发酵时间6d，发酵温度34℃，新基质曲添加量15%，泡米时间7h。在此条件下酿出的黑糯米酒感官评分为86分，总酚含量为0.85mg/m L。 （3）采用代谢组学方法对黑糯米酒发酵72h内代谢物进行了跟踪研究。结果表明，黑糯米酒发酵过程中共鉴定出344种代谢物，包括糖、糖醇、有机酸、氨基酸、脂肪酸、酚酸和未知名称的等差异代谢物，其中33种被确定为显著差异代谢物(VIP＞1且p＜0.05)。热图显示33种差异代谢物可按发酵时间将其分为4大类，且发酵60h阶段富集的差异代谢物数量最多。代谢通路分析表明33种差异代谢物涉及18个途径，包括3个显著相关的途径(p＜0.05且Pathway impact＞0.1)，分别为淀粉蔗糖代谢、丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢和戊糖磷酸途径。进一步将关键代谢途径进行整合分析表明，淀粉蔗糖代谢和丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢主要发生在黑糯米酒发酵前24h，而戊糖磷酸途径主要发生在发酵36-60h之间。在6个不同发酵阶段得到不同数量的差异代谢物，随着发酵进行，差异代谢物数量和种类均发生变化。将过程特异性代谢物与相应的物理化学因子及酶表型相关联发现，随着发酵时间延长，酸类物质增多，醪糟液pH值下降，总酸升高，与代谢物变化情况一致。随着纤维素酶、果胶酶和糖化酶活力增高，多聚糖含量下降，单糖和低聚糖含量增高。蛋白酶活力增高，氨基酸含量增加。在6个不同发酵阶段得到不同数量的差异代谢物，随着发酵进行，差异代谢物数量和种类均发生变化。果糖在前三个发酵阶段为差异代谢物，麦芽糖除第三阶段不是差异代谢物，在其他过程均为差异代谢物，说明这两种糖很有可能对米酒品质影响极大。

目录

第一章 绪论

1.1酒曲简介

1.2黑糯米酒简介

1.2.1黑糯米

1.2.2黑糯米酒现状及研究进展

1.2.3药食同源物质

1.3代谢组学技术在发酵食品中的应用

1.4课题的研究背景及意义

1.4.1课题来源

1.4.2研究目的及意义

1.4.3主要研究内容

1.4.4技术路线

第二章 响应面法优化药食同源基质制曲工艺

2.1 引言

2.2材料、仪器和试剂

2.2.1实验材料

2.2.2实验仪器

2.2.3实验试剂

2.3实验方法

2.3.1纤维素酶和蛋白酶标准曲线

2.3.2新型曲制曲工艺优化

2.3.3 酒曲酶系的测定

2.3.4 GC-MS测定米酒的挥发性物质

2.4实验结果与分析

2.4.1纤维素酶和蛋白酶标准曲线结果

2.4.2新基质曲制曲工艺优化结果

2.4.3响应面试验结果

2.4.4 酒曲酶系的测定结果

2.4.5 GC-MS测定米酒的挥发性物质结果

2.5 结论

第三章 黑糯米酒酿酒工艺优化

3.1 引言

3.2材料、仪器和试剂

3.2.1实验材料

3.2.2实验仪器

3.2.3实验试剂

3.3实验方法

3.3.1黑糯米酒酿酒工艺优化

3.3.2 黑糯米酒感官评价方法

3.3.3总酚含量的测定

3.3.4数据处理

3.4实验结果与分析

3.4.1没食子酸标准曲线

3.4.2黑糯米酒酿酒工艺优化

3.5结论

第四章 黑糯米酒发酵过程中差异代谢物的研究

4.1 引言

4.2材料、仪器和试剂

4.2.1实验材料

4.2.2实验仪器

4.2.3实验试剂

4.3实验方法

4.3.1样品制备

4.3.2黑糯米酒发酵过程GC-TOF-MS分析

4.3.3黑糯米酒发酵过程理化分析

4.3.4 数据处理和统计分析

4.3.5 发酵过程差异代谢物热图分析

4.3.6代谢物代谢通路分析

4.3.7 黑糯米酒发酵过程各阶段S-plot分析

4.4实验结果与分析

4.4.1黑糯米酒发酵过程GC-TOF-MS分析图谱

4.4.2 数据控制

4.4.3黑糯米酒前发酵过程理化实验结果及分析

4.4.4主成分分析和正交偏最小二乘判别结果及分析

4.4.5 发酵过程差异代谢物热图结果及分析

4.4.6 代谢物代谢通路结果及分析

4.4.7黑糯米酒发酵过程各阶段S-plot图结果及分析

4.5 结论

第五章 结论与展望

5.1主要研究结果

5.2 展望

5.2.1 多组学联用

5.2.2 多技术联用

致谢

参考文献

附录

附表

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