遗传性异常纤维蛋白原血症FGA基因鉴定及分子致病机制研究

摘要

目的:
　　遗传性异常纤维蛋白原血症（Congenital Dysfibrinogenemia，CD）是一种罕见的遗传性疾病，常因纤维蛋白原(Fg)三个同源编码基因缺陷，从而引起纤维蛋白原结构与功能异常。该病临床表现高度异质性:出血、血栓或者无任何症状。国外一项跟踪随访研究报道，在疾病的发展过程中，无症状CD患者在基因与环境相互作用下，临床表现会有所改变，可能有出血表现或者血栓形成。CD的诊断主要依靠临床实验室检查。其实验室诊断标准为:TT明显延长，纤维蛋白原活性水平与纤维蛋白原抗原浓度之间存在显著性差异。应用Clauss法检测Fg活性水平，PT换算法或免疫比浊法检测Fg抗原浓度。明确CD的基因突变位点对CD诊断、治疗与优生优育产前基因诊断尤为重要，还可帮助进一步深入探究CD的分子致病机制，并且对患者出血、血栓等的风险评估很有价值。
　　方法:
　　(1)收集4个CD先证者及家系成员的病史资料、做好家系调查;(2)提取血细胞DNA，设计并合成特异性引物，用PCR扩增FGA、FGB、FGG基因所有外显子及侧翼序列，获得目的产物，进行直接测序分析，查找患者基因突变类型;(3)提取并纯化患者血浆Fg，进行质谱检测，分析变异肽段;(4)应用Western blot检测分析患者Fg肽链的相对表达量，以明确Fg缺陷类型;(5)根据相应的突变位点，进行纤维蛋白肽释放试验、纤维蛋白聚集试验及纤维蛋白溶解试验分析;(6)扫描电子显微镜观察纤维蛋白网状结构。通过以上方法，初步探讨CD患者分子致病机制。
　　结果:
　　(1)4个先证者的凝血检测结果特征为:Fg抗原浓度（PT换算法）正常，而Fg活性水平（Clauss法）低，TT显著延长。(2)基因测序发现先证者Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ为纤维蛋白原FGA第2外显子g.1232G＞A杂合突变，即AαArgl6His错义突变。先证者Ⅳ为FGA第2号外显子发生g.1233C＞T杂合突变，即AαArg16Cys错义突变。(3)质谱检测发现4例先证者均存在变异肽段;Western blot检测分析患者Fg肽链相对表达量无异常变化。(4)4例先证者的纤维蛋白肽A释放率与释放总量均明显降低，聚集曲线中均可见明显延长聚集期，最大OD值低于健康对照;溶解曲线中出现明显停滞期，50％溶解时间延迟。(5)电镜观察到4例先证者的纤维更纤细，粗细不均，形成的纤维蛋白网状结构疏松，网状孔径较大。
　　结论:
　　1.本研究报道的Aα16Arg→His与Aα16Arg→Cys为热点突变，结果与国内国外文献报道一致。
　　2.成功运用Western Blot研究CD患者Fg缺陷类型，结合SDS-PAGE蛋白电泳技术，分析Fg肽链的相对表达量无异常变化。
　　3.Aα链第16位Arg突变为His或者Cys均能引起凝血酶与纤维蛋白原结合异常，导致纤维蛋白肽释放减少，进一步引起聚集反应与纤溶反应异常。以上为本研究4个遗传性异常纤维蛋白原血症家系的分子致病机制。

目录

声明

个人简历

摘要

前言

1 实验资料

2 实验方法

1 凝血表型检测结果

3 纤维蛋白原Western-blot检测结

4 FGA基因突变分析结果

5 质谱检测分析结果

6 纤维蛋白肽释放试验结果

7 纤维蛋白聚集功能分析结

8 纤维蛋白溶解曲线结果

9 扫描电镜观察结果

讨论

结论

参考文献

综述 遗传性异常纤维蛋白原血症及其实验室检查

附录

致谢

硕士期间发表的论文