PI3K/Akt信号通路在地塞米松对成骨细胞功能影响中的作用

摘要

目的:研究地塞米松对体外培养的成骨细胞增殖、骨形成和凋亡的影响，及其可能的作用机制。 方法:体外分离培养SD大鼠成骨细胞，观察细胞形态，应用碱性磷酸酶(ALP)染色法和茜素红染色法鉴定成骨细胞。取第三代生长良好的成骨细胞，分组方法如下:(1)根据地塞米松(Dexamethasone，Dex)作用浓度分为对照组(0mol/L Dex)、10-8mol/L Dex组、10-7mol/L Dex组、10-6mol/LDex组干预12、24、48h;选择地塞米松作用明显的浓度10-6mol/L用于后续实验。(2)应用PI3K激动剂740Y-P进一步验证地塞米松对成骨细胞增殖、功能和凋亡的影响。分组为:分为对照组(0mol/L地塞米松，0mol/L740Y-P)、740Y-P组（0mol/L地塞米松，10μmol/L740Y-P）、地塞米松组（10-6mol/L地塞米松，0mol/L740Y-P）、740Y-P+地塞米松组（10μmol/L740Y-P，10-6mol/L地塞米松）干预48h。培养结束后，运用CellCounting Kit-8(CCK-8)法检测细胞增殖活力，采用AnnexinⅤ/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡率，ALP染色检测成骨细胞ALP的活性，免疫荧光法观察ALP和凋亡指标caspase-3的表达，Western blot检测成骨细胞中ALP、骨钙素(OCN)、caspase-3、caspase-9、p-PI3K、p-Akt蛋白的表达。采用单因素方差分析，组间两两比较方差齐采用LSD-t检验。 结果:1.用地塞米松在干预12h，10-7mol/L、10-6mol/LDex可明显降低细胞增殖活力，与对照组相比，差异有统计学意义（均P＜0.05），10-8mol/L Dex对成骨细胞的增殖无明显抑制作用(P＞0.05)。当地塞米松干预48h时，各地塞米松浓度组成骨细胞增殖活性均明显下降，与对照组相比，差异有统计学意义（均P＜0.05）;与10-8mol/L组相比，10-7mol/L、10-6mol/L Dex组细胞增殖活性均显著减少（均P＜0.05）;与10-7mol/L组相比，10-6mol/L Dex组成骨细胞增殖活性明显下降（P＜0.05）。提示地塞米松抑制成骨细胞增殖呈剂量依赖性;同一浓度Dex干预12h、24h和48h比较，随着地塞米松作用时间的延长，成骨细胞增殖率逐渐降低。表明地塞米松可抑制成骨细胞增殖，作用时间越长，抑制作用越明显。 2.不同浓度地塞米松干预成骨细胞48h后，10-7mol/L、10-6mol/LDex组成骨细胞凋亡率明显升高，与对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。10-8mol/L地塞米松组细胞凋亡率无明显变化(P＞0.05)。与10-8mol组相比，10-7mol/L、10-6mol/L地塞米松组细胞凋亡率明显增加，差异有统计学意义（均P＜0.05），表明高浓度地塞米松明显增加成骨细胞凋亡。 3.采用10-6mol/L地塞米松干预成骨细胞24、48h后，行ALP染色。与0h组相比，干预24、48h后成骨细胞的ALP活性均明显减少(P＜0.05)。与24h组相比，干预48h成骨细胞ALP活性明显下降(P＜0.05)，提示10-6mol/LDex抑制成骨细胞ALP的活性呈时间依赖性。 4.采用10-6mol/L地塞米松干预成骨细胞12、24、48h后行免疫荧光染色。与0h组相比，干预12、24、48h后成骨细胞的ALP表达均明显减少(P＜0.05)。与12h组相比，干预24h、48h组成骨细胞ALP表达明显减少(P＜0.05)。提示地塞米松作用时间越长，其对ALP表达的抑制作用越明显。与0h组相比，干预12h成骨细胞的凋亡指标caspase-3表达无明显变化（P＞0.05）。干预24h、48h成骨细胞caspase-3表达较对照组明显增加(P＜0.05)，与24h组相比，干预48h成骨细胞caspase-3表达明显增加（P＜0.05），表明地塞米松可上调caspase-3表达，诱导成骨细胞凋亡;地塞米松作用时间越长，上述变化越明显。 5.与对照组相比，10-7mol/L和10-6mol/L地塞米松组的成骨细胞的骨形成指标ALP和OCN、p-PI3K和p-Akt蛋白表达明显减少（P＜0.05）;凋亡指标caspase-3、caspase-9表达明显增加（P＜0.05）。与10-8mol/L地塞米松组比较，10-6mol/L地塞米松组成骨细胞ALP、OCN、p-PI3K和p-Akt表达明显减少（P＜0.05）;caspase-3、caspase-9表达明显增加（P＜0.05），提示高浓度地塞米松显著抑制ALP、OCN、p-PI3K和p-Akt蛋白的表达，上调caspase-3和caspase-9的表达。本研究选择作用最明显的10-6mol/L地塞米松用于后续实验。 6.与对照组相比，10μmol/L740Y-P（PI3K激动剂）促进成骨细胞增殖（P＜0.05），上调成骨细胞p-Akt蛋白的表达（P＜0.05），对成骨ALP活性和凋亡无明显影响（P＞0.05）;与单纯地塞米松组相比，Dex+740Y-P联合组的成骨细胞增殖活力及ALP活性明显升高，凋亡率明显减少（P＜0.05）;p-Akt、ALP、OCN蛋白表达明显增加(P＜0.05);caspase-3、caspase-9表达明显减少（P＜0.05）。 结论:1.地塞米松可抑制成骨细胞增殖和骨形成，诱导成骨细胞凋亡，呈剂量和时间依赖性。 2.PI3K/AKT信号通路可能参与了地塞米松对成骨细胞不良影响。