壳聚糖酶产生菌的育种、发酵条件优化和壳寡糖的酶解制备

摘要

本课利用实验室保藏的壳聚糖酶产生菌-烟曲霉CK(Aspergillus fumigatus CK)作为出发菌株，对菌种选育、发酵条件优化和酶解条件进行了深入地研究，方案和结果如下： 首先利用紫外线和60Co对烟曲霉进行复合诱变处理并进行抗分解代谢物筛选，以壳聚糖作为唯一氮源，葡萄糖作为碳源，同时葡萄糖作为抗分解代谢阻遏物，选育获得一株抗分解代谢阻遏的高产突变株UC-19。起始菌株壳聚糖酶活是5.3U/mL，突变株UC-19壳聚糖酶活达到14.6U/mL，比起始菌株提高了175％。 然后运用响应面分析对烟曲霉产酶条件进行优化，首先采用部分因子实验筛选出影响壳聚糖酶产量的显著因子牛肉膏和CaCl2；然后利用最陡爬坡路径逼近最大产酶区域。 最后应用中心组合设计和响应面分析确定突变株UC-19产壳聚糖酶的最佳培养基组成。经过优化，其最佳培养基组成为(％，w/v)：壳聚糖1.5、牛肉膏2.1、KH2PO4 0.1、MgSO4·7H2O 0.1、CaCl2 0.4、tween-80 0.1，pH 5.5～6.0在此条件下发酵液中壳聚糖酶活可达44.24U/mL，比优化前酶活(13.01 U/mL)提高了225％。 利用所产的壳聚糖酶进行壳寡糖的生产，壳聚糖酶活约为18U/mL，壳聚糖和酶液的量比为1：3(g/v)，分别在60℃、65℃和70℃水浴下水解，研究了水解过程中还原糖量和A420色度值随着水解时间的变化情况，得出最佳的水解条件为温度为60℃，时间为100min，此时还原糖量/A420色度值最大，达到79.03。水解后，在温度60℃和活性炭用量2.5％(g/v)下脱色35min，脱色后的酶解液经过喷雾干燥，做成固体壳寡糖，经过对其平均聚合度和分子量的测量，壳寡糖的平均聚合度为3，平均分子量为500。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

1.1壳聚糖酶概述

1.1.1壳聚糖酶的发现

1.1.2壳聚糖酶的分布

1.2壳聚糖酶的性质

1.2.1分子量

1.2.2等电点与最适pH

1.2.3酶的最适反应温度与稳定性

1.2.4壳聚糖酶的催化性质

1.3壳聚糖酶的分类

1.3.1根据酶对糖苷键的水解分类

1.3.2根据酶的氨基酸序列分类

1.4国内外研究进展

1.5壳寡糖的制备

1.5.1化学制备法

1.5.2物理制备法

1.5.3酶解制备法

1.6展望

1.7研究目的和意义

第二章壳聚糖酶产生菌Aspergillus fumigatus CK的抗分解代谢物育种

2.1前言

2.2实验材料与仪器设备

2.2.1菌株

2.2.2培养基

2.2.3主要试剂和仪器

2.3实验方法

2.3.1纯化和复壮方法

2.3.2诱变方法

2.3.3培养条件

2.3.4分析方法

2.4结果与分析

2.4.1出发菌株的复壮

2.4.2抗分解代谢物突变菌株的筛选

2.4.3出发菌株与抗分解代谢物突变菌株的菌落特征比较

2.4.4出发菌株和UC-19突变菌株产酶曲线

2.5本章小结

第三章响应面分析优化Aspergillus fumigatus UC-19发酵条件

3.1前言

3.2实验材料与仪器设备

3.2.1菌株

3.2.2培养基

3.2.3主要试剂和仪器

3.3培养条件

3.3.1种子培养方法

3.3.2种子生长曲线

3.3.3发酵培养方法

3.3.4分析方法

3.3.5实验设计

3.4实验结果

3.4.1种子生长曲线

3.4.2部分因子设计实验结果

3.4.3最陡爬坡实验结果

3.4.4中心组合设计和响应面分析实验结果

3.5本章小结

第四章壳聚糖酶的沉淀分离

4.1前言

4.2菌株与仪器设备

4.2.1菌株

4.2.2主要试剂和仪器

4.3培养基和培养方法

4.3.1种子培养基

4.3.2发酵培养基

4.3.3分析方法

4.3.4壳聚糖酶的硫酸铵沉淀

4.3.5壳聚糖酶的乙醇沉淀

4.4实验结果

4.4.1壳聚糖酶的硫酸铵沉淀

4.4.2壳聚糖酶的乙醇沉淀

4.5本章小结

第五章酶法制备壳寡糖

5.1前言

5.2实验材料与仪器设备

5.3实验方法

5.3.1酶解反应

5.3.2脱色和喷雾干燥

5.3.3壳寡糖的平均聚合度和平均分子量的测定

5.4实验结果

5.4.1酶解反应

5.4.2脱色和喷雾干燥

5.4.3壳寡糖平均聚合度和平均相对分子量的测定

5.5本章小结

第六章总结和建议

6.1总结

6.2 建议

参考文献

附录

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文