氧化型辅酶NAD+对小鼠抗辐射损伤的实验研究

摘要

研究背景：
　　 肿瘤放射治疗是恶性肿瘤治疗的一种重要手段,除治疗恶性肿瘤外,还用于治疗一些良性肿瘤。肿瘤放射治疗最佳效果在于最大程度杀伤肿瘤细胞而尽量降低正常组织细胞的放射损伤,即在正常组织能够耐受的条件下,最大限度地杀灭肿瘤细胞。但临床上往往难以控制在射线杀灭肿瘤组织的同时而不损伤正常组织。随着科学技术的发展和辐射应用的日渐广泛,辐射防护的研究日趋热门,医疗上接受诊断和化疗的患者,暴露在特殊环境下的损伤,在杀伤肿瘤细胞的同时,正常细胞也受到损伤,如何从根本上减少辐射对正常组织带来的损伤,也成为辐射领域学者关注的课题。近期关于抗辐射剂的研究较多,这些物质主要用于抵抗射线对健康机体的损伤、提高肿瘤细胞对辐射的敏感性、修复受损细胞消除自由基等方面起作用。有关辐射损伤防护剂的研究主要集中在以下几个方面[1]:(1)硫化合物,半胱胺、氨乙基异硫脲、胱胺、S-2-(3-氨基丙胺基)乙基硫代磷酸酯(WR2721)等。(2)激素类,戊酸雌二醇、环戊烷丙酸雌二醇、棕榈酸雌二醇双酯、苯甲酸雌二醇、炔雌醇、500、522、523,以及雄激素类雄烯二醇等。(3)植物类,人参、多糖、生物碱、酚类皂苷、香豆素类。(4)细胞因子类,如GM-CSF、G-CSF、IL-3、EPO、TPO、IL-11、SCF等。(5)目前研究的新型药物,CBLB502、美洛昔康、雷米普利、卡托普利、特异性免疫球蛋白等。但由于目前研究较多的抗氧化剂毒副作用大,细胞因了作用网络化特点以及中草药成分难以提纯,还没有一种较为理想的辐射防护剂应用于临床。寻找一种新的有效的、毒副作用小的辐射防护药物是辐射防护学待解决的关键问题。
　　 氧化型辅酶NAD+,化学名为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,在哺乳动物的新陈代谢过程中起重要作用,其通过调节SIRT1活性控制转录,除此之外,它还是细胞能量代谢的重要辅酶,参与细胞氧化还原反应和呼吸链电子传递,在线粒体内NAD+接受电子传递还原成NADH,通过电子传递能够抑制自由基生成,增加谷胱甘肽含量,抑制细胞色素C从线粒体释放,同时生成细胞代谢所需的ATP,1分子NADH被氧化可产生3分子ATP。NADH在线粒体内能够抑制自由基生成和线粒体膜电位下降等。有研究提示,神经细胞缺乏NADH可导致神经元变性坏死,并与阿尔茨海然病遗传易感性存在一定相关性[2]。神经母细胞痛细胞中NADH表达调控的改变,可能与神经母细胞瘤的发生有关[3]。NADH选择性剪接的异常可能与宫颈鳞痛的发生发展密切相关[1]。紫外线照射后表皮细胞内NADH含量与表皮细胞发展为癌前病变有关。组织细胞辐射后,细胞内NADH含量下降,参与细胞DNA修复的PARP失活,导致细胞辐射后修复能力下降。通过外源性给予NADH,能够增加神经细胞多巴胺神经递质释放,改善帕金森氏综合症:能够抗鱼藤酮引起的细胞损伤及调节细胞凋亡相关基因表达。综上所述,NADH有调节辐射对细胞的损伤的作用,但NADH难于生产,保存困难,价格昂贵,NAD+不存在以上缺点,在线粒体内NAD+接受电了传递还原成NADH,因此,本实验通过研究NAD+对小鼠抗辐射损伤作用,研制一种新型的辐射防护剂。
　　 目的：
　　 本研究通过研究NAD+对辐射损伤小鼠造血功能、免疫功能及各脏器功能的影响,探讨NAD+对昆明小鼠的抗辐射损伤修复能力,为研究新型放射防护剂提供新的思路和手段。
　　 方法
　　 1.昆明小鼠随机分为3组,每组10只,正常对照组Ⅰ、照射对照组Ⅱ、NAD+照射组Ⅲ,采用直线加速器一次性全身照射,照射剂量为6 Gy,分别于照射前3天,每天腹腔给药1次。
　　 2.照射后第1、7、15天自动血球计数仪观察小鼠外周血白细胞变化。
　　 3.照射后24小时计数骨髓细胞有核细胞数。
　　 4.照射后24小时,流式细胞仪测骨髓细胞凋亡率。
　　 5.照射后24小时,酶标仪检测骨髓细胞Caspase-3的活性。
　　 6.照射后第10天,取脾、胸腺测脾指数、胸腺指数,脾淋巴细胞Caspase-3的活性、脾淋巴细胞凋亡率,并观察脾光镜下组织结构变化。
　　 7.照射后第10天,取心、肝、肾经HE染色,光镜下观察组织结构变化。
　　 8.统计学处理 实验所得数据应用SPSS15.0统计软件进行处理。以重复测量数据的方差分析对各组及各时间点的白细胞计数进行差异性分析,其余数据采用单因素方差分析。计量资料用-x±s表示,p<0.05为差异具有统计学意义。
　　 结果
　　 (一)NAD+对辐射损伤小鼠造血功能影响
　　 1 NAD+对受照大鼠外周血白细胞的影响
　　 照射后第7d,各组小鼠白细胞降至最低,之后逐渐回升。照射后第15d,NAD+照射组WBC己恢复至照射前的92％,而单纯照射组WBC仅恢复罕照射前的73％。
　　 2 NAD+对受照小鼠骨髓有核细胞数的影响
　　 NAD+照射组的股骨骨髓有核细胞数较正常对照组低但比照射对照组高。
　　 3 小鼠骨髓细胞凋亡率的变化
　　 照射后24小时,NAD+照射组骨髓细胞凋亡率较照射对照组低。
　　 4 NAD+对受照小鼠骨髓细胞Caspase-3的活性的影响
　　 照射后24小时,NAD+照射组骨髓细胞caspase-3的活性较照射对照组明显降低。
　　 (二)NAD+对辐射损伤小鼠免疫功能影响
　　 1 NAD+对昆明小鼠受照后脾、胸腺指数的影响。
　　 NAD+照射给药组的脾指数和胸腺指数均高于照射对照组.
　　 2 小鼠脾淋巴细胞凋亡率检测结果
　　 照射后10d,小鼠脾淋巴细胞经流式细胞仪检测,照射对照组的脾淋巴细胞凋亡率高于正常对照组,NAD+照射给药组的脾淋巴细胞凋亡率均低于照射对照组,可知,NAD+有抑制辐射损伤小鼠脾淋巴细胞凋亡作用。
　　 3 NAD+对受照小鼠脾淋巴细胞Caspase-3的活性的影响
　　 照射后10d,检测脾淋巴细胞Caspase-3的活性,结果显示照射对照组的脾淋巴细胞Caspase-3活性高于正常对照组,NAD+照射组小鼠脾淋巴细胞Caspase-3的活性较照射对照组明显降低。
　　 4 小鼠脾组织学改变
　　 经HE染色,照射对照组脾小体较正常对照组和NAD+照射组明显缩小,生发中心不明显,脾中央动脉狭窄,并伴有多量出血,NAD+照射组虽然脾小体较正常对照组少,但较照射对照组多.
　　 (三)NAD+对辐射损伤小鼠心、肝、肾影响
　　 1 心脏组织学改变
　　 照射后10d,小鼠心脏HE染色显示各组心脏组织结构、细胞形态上无明显区别。
　　 2 肝脏组织学改变
　　 照射后10d,小鼠肝脏HE染色显示照射对照组大部分肝组织细胞变性、坏死,以气球样变为主,NAD+照射组肝组织细胞变性坏死较照射对照组明显减轻.
　　 3 肾脏组织学改变
　　 照射后10d,小鼠肾脏HE染色显示照射组肾脏体积缩小,皮质比例减小,肾小管上皮细胞间隙增大,胞质内空泡状结构增多,部分上皮细胞肿胀、坏死。肾小球在光镜下观察变化不明显,NAD+照射组肾小管细胞变化较照射对照组明显减轻.
　　 结论
　　 本实验通过对受照小鼠造血功能、免疫功能的研究结果表明:NAD+能对抗辐射引起小鼠外周血白细胞的下降,增加小鼠骨髓有核细胞数及受照小鼠的存活率,降低小鼠骨髓细胞、脾淋巴细胞凋亡率及骨髓细胞、脾淋巴细胞Caspase-3的活性,能增加脾、胸腺指数,抑制辐射对脾、肝、肾脏组织损伤,对心脏影响不明显。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一部分 NAD+对辐射损伤小鼠造血功能影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

第二部分 NAD+对辐射损伤小鼠免疫功能影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

第三部分 NAD+对辐射损伤小鼠心、肝、肾的影响

1 材料

2 方法

3. 结果

4. 讨论

5 小结

全文结论

参考文献

文献综述

参考文献

附录 :缩略词

攻读学位期间成果

致谢

统计学证明