xCT调节弥漫大B细胞淋巴瘤细胞氧化还原状态介导化疗敏感性的研究

摘要

目的：
　　在DLBCL中，xCT是否能够通过调整肿瘤细胞的氧化还原状态介导肿瘤细胞对化疗的敏感性，我们拟探讨xCT在DLBCL，特别是在ABC-DLBCL中，对肿瘤细胞的氧化还原状态、增殖、凋亡的影响及其可能的机制，进而为DLBCL预后的判断，及新的治疗途径提供思路。
　　方法:
　　1、xCT在DLBCL中的表达分布及其与CD44V8-10的关系:
　　选择14中DLBCL细胞株（8种ABC-DLBCL株，5种GCB-DLBCL株）通过qRT-CR，Western blot和流式细胞术（Flow CytoMetry，FCM）分别检测xCT及CD44的表达，评价其在不同DLBCL亚型中的表达差异及xCT与CD44v8-10的关系。
　　2、xCT及其抑制剂柳氮磺吡啶（sulfazalazine，SASP）对ABC-DLBCL细胞增殖、凋亡的影响及其可能的机制
　　通过xCT siRNA沉默SuDHL2和Riva两种细胞株中xCT的表达，qRT-CR和Western blot评价干扰效果。分别运用Dox处理对照组和实验组细胞，比较两组细胞在增殖及凋亡方面的差异，FCM评价两组ROS水平的差异。Western blot评价氧化应激相关信号转导通路蛋白p38 MAPK/p-p38 MAPK、JNK/p-JNK，及凋亡调节蛋白Bax、Bim、Mcl-1、Bcl-2及Caspase的激活状态。
　　运用xCT抑制剂SASP分别处理SuDHL2和Riva两种细胞株，比较对照组和实验组在增殖和凋亡方面的差异，FCM评价两组的ROS水平的差异。Westernblot评价相关信号转导通路蛋白p38 MAPK/p-p38 MAPK、JNK/p-JNK，及凋亡调节蛋白Bax、Bim、Mcl-1、Bcl-2及Caspase的激活状态。
　　3.xCT抑制剂SASP增强肿瘤细胞对Dox的敏感性及其可能的机制。
　　分别联合SASP和Dox处理SuDHL2和Riva细胞，比较对照组和实验组在增殖、凋亡、ROS及GSH方面的差异。同时通过Western blot评价氧化应激相关信号转导通路蛋白p38 MAPK/p-p38 MAPK、JNK/p-JNK及凋亡调节蛋白Bax、Bim、Mcl-1、Bcl-2及Caspase的激活状态。
　　联合Glutathione ethyl ester(GEE)和SASP及Dox处理SuDHL2和Riva细胞，比较对照组和实验组在增殖、凋亡、ROS及GSH方面的差异。同时通过Western blot评价氧化应激相关信号转导通路蛋白p38MAPK/p-p38 MAPK、JNK/p-JNK及凋亡相关蛋白PARP的表达。
　　联合p38抑制剂SB203580和SASP及Dox处理SuDHL2和Riva细胞，比较对照组和实验组在增殖及凋亡方面的差异。同时通过Western blot评价氧化应激相关信号转导通路蛋白p38MAPK/p-p38 MAPK及凋亡相关蛋白PARP的表达。
　　结果:
　　1、xCT mRNA在所有的14中DLBCL细胞株中均有表达，独立样本t检验的结果显示xCT mRNA在ABC-DLBCL细胞株中的的表达水平高于GCB-DLBCL细胞株，但差别无统计学意义(t=2.323，P=0.053)。Western Blot的结果显示xCT在所有的DLBCL细胞株中均有表达，独立样本t检验结果显示两种DLBCL亚型之间Western blot灰度值总体方差齐（F=0.004，P=0.948），xCT的表达水平在ABC-DLBCL和GCB-DLBCL两种亚型之间无显著性差异(t=0.328, P=0.750)。
　　CD44 mRNA和蛋白在所有的DLBCL细胞株中均有表达。CD44 mRNA在ABC-DLBCL细胞株中的表达水平显著高于GCB-DLBCL细胞株(t=2.745，P=0.029)。FCM的结果显示CD44膜蛋白在ABC-DLBCL细胞株中的表达水平显著高于GCB-DLBCL细胞株（t=2.878，P=0.045）。
　　CD44v8-10只在ABC-DLBCL细胞株Pfeiffer细胞株中表达，而在其余的ABC-DLBCL和GCB-DLBCL细胞株无表达。提示在DLBCL细胞株中xCT的表达与CD44v8-10可能无明显相关性。
　　2、xCT siRNA转染Riva及SuDHL2细胞后分别与48h、72h及96h采用RIPA裂解液提取蛋白，Western Blot评价xCT的表达水平。结果发现在Riva细胞中xCT表达稳定，xCT siRNA处理96h后，xCT仍无明显降低。同样的是在SuDHL2中xCT siRNA处理72h后，xCT仍无明显降低。蛋白抑制剂Cycloheximida分别处理Riva、SuDHL2及Ly3-S细胞4h、8h、12h、16h、24h、48h后，用RIPA裂解液提取蛋白。以c-myc为阳性对照，Western Blot评价xCT及c-myc的表达，结果发现在Riva、SuDHL2及Ly3-S接受处理后的4h，细胞内c-myc的表达已完全消失，而即使处理48h之后xCT的表达并无明显降低。提示xCT具有很长的半衰期。
　　xCT的抑制剂SASP在极低浓度时能够促进细胞增殖，而在高浓度时则抑制肿瘤细胞的增殖。以SASP IC50时的浓度分别处理Riva和SuDHL2细胞24h后，能够明显降低Riva和SuDHL2细胞内的GSH水平(P＜0.001，0.001)，同时升高细胞内ROS的水平(P＜0.001，0.001)。SASP分别处理Riva和SuDHL2细胞12及24小时后，能够明显促进氧化应激下游蛋白p-p38 MAPK的激活。同时凋亡抑制蛋白Mcl-1、Bcl-2降低，而凋亡相关蛋白Cleaved PARP、Bax、Bim表达水平上调。
　　3、和Dox单药处理组相比，SASP联合Dox能够抑制Riva(F=877.265，P＜0.001)和SuDHL2细胞（F=106.021，P＜0.001）的增殖，增加Riva(F=1131.469，P＜0.001)和SuDHL2细胞（F=3332.651，P＜0.001）的凋亡，提高Riva(F=459.84，P＜0.001)和SuDHL2细胞（F=472.63，P＜0.001）的ROS水平。Western Blot的结果显示Dox联合SASP能够增加氧化应激相关蛋白p-p38 MAPK及p-JNK的表达。同时上调凋亡相关蛋白Cleaved PARP、Bax、Bim在Dox和SASP联合组的表达水平，抑制凋亡抑制蛋白Bcl-2及Mcl-1的表达水平。
　　在Riva和SuDHL2细胞中，GEE预处理细胞后，再联合SASP及Dox能够降低SASP联合Dox所诱导的ROS的水平(P＜0.001，＜0.001)，减少二者所诱导的细胞凋亡（P＜0.001，0.001）。Western Blot的结果显示GEE能够抑制SASP联合Dox所诱导的p38及JNK的磷酸化，同时抑制PARP的水解。
　　在Riva和SuDHL2细胞中，p38抑制剂预处理细胞后，再联合SASP及Dox能够减弱SASP联合Dox所诱导的细胞毒效应(P＜0.001，0.001)，减少二者所诱导的细胞凋亡（P＜0.001，0.001）。Western Blot的结果显示p38抑制剂能够同时抑制PARP的水解，但是对于p38的磷酸化无明显影响，
　　结论:
　　1.xCT mRNA和蛋白在所有ABC-DLBCL细胞株和GCB-DLBCL细胞株中均有表达，其中xCT mRNA在ABC-DLBCL的表达水平高于GCB-DLBCL细胞株，但是二亚型之间的蛋白表达水平无明显差异。CD44 mRNA和蛋白在ABC-DLBCL细胞株和GCB-DLBCL细胞株中均有表达，且CD44 mRNA和蛋白在ABC-DLBCL细胞株中表达水平明显高于GCB-DLBCL细胞株。在14中DLBCL细胞株中，只有Pfeiffer细胞株中检测到CD44v8-10表达，提示在DLBCL中CD44v8-10可能不是调节xCT的主要因子。
　　2.xCT表达在所检测的3种ABC-DLBCL中稳定表达，具有很长的半衰期。xCT抑制剂SASP能够降低ABC-DLBCL细胞内GSH的水平，同时升高ROS水平，诱导凋亡，增加氧化应激相关蛋白p-p38 MAPK及p-JNK的表达。同时诱导凋亡相关蛋白Cleaved PARP、Bax、Bim表达上调，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2及Mcl-1的表达，促进肿瘤细胞凋亡，抑制其增殖活性。
　　3.SASP联合Dox能够进一步升高ABC-DLBCL细胞内ROS水平，增加氧化应激相关蛋白p-p38 MAPK及p-JNK的表达。同时诱导凋亡相关蛋白CleavedPARP、Bax、Bim表达上调，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2及Mcl-1的表达，促进肿瘤细胞凋亡，抑制其增殖活性。从而增强ABC-DLBCL肿瘤细胞对Dox的敏感性。ROS水平的增加和p38的激活是SASP和Dox联合诱导细胞凋亡的决定性因素。

目录

摘要

前言

第一部分 xCT在DLBCL细胞株中的表达分布及其与CD44V8-10的关系

研究材料及方法

研究材料

实验方法

1．6 结果

1．4 讨论

第二部分 xCT及其抑制剂柳氮磺吡啶对DLBCL细胞增殖凋亡的影响及其可能的机制

研究材料及方法

研究对象

实验方法

2．10 结果

2．11 讨论

第三部分 xCT抑制剂柳氮磺吡啶增强肿瘤细胞对阿霉素的敏感性及其可能的机制

研究材料及方法

研究对象

实验方法

3．8 结果

3．9 讨论

参考文献

全文总结

英语缩略词表

在研期间发表论文

在研期间所获奖励

致谢

声明

统计学审稿证明