新型去乙酰化酶抑制剂厚朴酚激活TRAIL通路诱导NSCLC凋亡的机制研究

摘要

目的：
　　本文研究目的在于考察厚朴酚和厚朴总酚对人非小细胞肺癌A549和H1299细胞中Ⅰ型HDACs的影响，并探索厚朴酚及厚朴总酚在体内外是否能作为HDACi诱导细胞凋亡。探索和发展新颖有效无毒并能调节表观遗传学的天然化合物对于治疗和预防肺癌是非常有必要的。
　　方法：
　　本研究采用MTT法、Real-time PCR、流式细胞仪检测细胞周期、流式细胞仪检测凋亡、Western blot、ChIP、裸鼠移植瘤模型、化学诱导肺癌模型和免疫荧光等技术，深入考察厚朴酚和厚朴总酚在体内外的抗肺癌作用及其机制。
　　1.MTT法细胞活力测试
　　取对数生长期的A549、H1299和H226细胞，4000/孔接种于96孔板中，培养24 h后，细胞生长状态良好后，弃去原来培养基，按设计的药物浓度厚朴酚(0，10，20，40，60，80，100，120，150μM)和厚朴总酚(0，4，8，16，21，26，32，40μg/mL)分别作用于48 h后停止培养，然后加入0.5 mg/mL的MTT溶液，处理4h后，弃上清，最后加入150μL DMSO振荡混匀，置于酶标仪中测定其吸光度值，测定波长为570 nm。细胞的活力相对于空白组的生存率为100％计算。
　　2.流式细胞仪检测细胞周期
　　A549、H1299、H226细胞经厚朴酚（0，15，30，60μM）和厚朴总酚(0，4，8，16μg/mL)处理48 h后，胰酶消化细胞，用PBS清洗后用预冷的75％乙醇固定细胞，密封保存于4℃冰箱过夜。次日，离心，用PBS洗一次，接着加入1 mL PBS，混匀后过筛，再加入500μL PI，涡旋混匀，然后将细胞置于37℃避光孵育30 min，充分混匀后，采用流式细胞仪检测细胞周期，用FlowJo v7.6软件处理数据。
　　3.流式细胞仪检测细胞凋亡
　　A549和H1299细胞经厚朴酚(0，15，30，60μM)和厚朴总酚(0，4，8，16μg/mL)处理48h后，用胰酶消化细胞，用PBS清洗。然后用100μL1x Bindingbuffer重悬细胞，再加入Annexin-Ⅴ和PI各5μL，在37℃避光孵育15 min。
　　4.Real-time PCR检测Ⅰ型HDACs和TRAL及其受体基因表达水平
　　A549和H1299细胞经厚朴酚(0，15，30，60μM)和厚朴总酚(0，4，8，16μg/mL)处理48h后，用TRIzol提取试剂提取细胞的mRNA，然后用逆转录试剂盒将mRNA逆转录为cDNA。最后用SYBR Green real-time PCR试剂盒扩增cDNA，并用ABI7500 system定量。
　　5.Western blot方法分析各蛋白的表达水平
　　A549和H1299细胞经厚朴酚(0，15，30，60μM)和厚朴总酚(0，4，8，16μg/mL)处理48h后，或者用TSA(500nM)预处理24 h，用胰酶消化收集细胞，提取总蛋白或核蛋白。蛋白用聚丙烯酰胺凝胶电泳（压缩胶为5％，分离胶为12％）分离，然后转移至PVDF膜。采用Western blot检测关键蛋白（Ⅰ型HDACs、Ac-H3、Ac-H4，AC p53，AC p65和凋亡关键蛋白）。利用β-actin和Histone H3作为内参，用ECL化学发光转化信号，蛋白的相对含量采用QuantityOne软件进行分析。
　　6.ChIP方法考察DR5基因的乙酰化位点
　　A549和H1299细胞经厚朴酚(60μM)和厚朴总酚(16μg/mL)处理后，用1％甲醛固定，用PierceTM Agarose ChIP Kit提取试剂盒提取DNA。DNA采用H3K27ac（4μg）孵育过夜。纯化的DNA（-1bp～-2500bp，2.5kb）用DR5特异性引物进行扩增，引物序列为正引物:5'-GGCGGCAGAGAAGACTTAAT-3';反引物:5'-CCTGAGGATGGAGACCTTATTTC-3'。采用10％ input作为对照。
　　7.建立A549异移植瘤模型考察厚朴酚及厚朴总酚的抗肿瘤作用
　　取对数生长期的2×106 A549细胞混悬于PBS接种于裸鼠右侧腋下。当平均肿瘤体积达到50-100 mm3时，分为4个组，每组7只。实验小鼠采用灌胃给药，具体给药剂量和方法如下:厚朴酚及厚朴总酚(20 mg/kg)溶解于200μL玉米油中，最终浓度为2 mg/mL，每周给五次;阿法替尼(5 mg/kg)混悬于含有0.5％甲基纤维素和0.4％吐温-80的生理盐水中，最终浓度为0.5 mg/mL灌胃给药每周五次;对照组给予0.1 mL/10g的玉米油，灌胃给药，每周五次。实验小鼠给药时长为4周，实验结束时，处死全部小鼠，剥取肿瘤，记录肿瘤的湿重。肿瘤体积利用游标卡尺每3天测量1次，计算公式为TV(mm3)=1/2×(L×W2)，公式中L为肿瘤的纵向长度，W为肿瘤横向长度。
　　8.TUNEL方法检测免疫组化的凋亡细胞
　　选用In Situ Cell Death Detection Kit，POD试剂盒，根据其使用方法，利用TUNEL方法检测体内肿瘤细胞凋亡情况，TUNEL-阳性细胞利用荧光显微镜采集数据。
　　9.化学诱导肺癌模型考察厚朴酚及厚朴总酚的预防作用
　　C57/B6小鼠适应一周后，用600 mg/kg乌拉坦进行造模，每周造模一次，共15周。第一次造模后根据体重进行分组给药，组别为空白模型组、厚朴酚(10mg/kg)、厚朴总酚组(10 mg/kg)。每组为20只，每周给药五次，每周测量体重;给药至30周。30周后进行解剖，取材，并且观察肺部结节及大小。
　　结果：
　　1.厚朴酚及厚朴总酚抑制非小细胞肺癌细胞的活力
　　采用MTT和流式细胞仪方法考察对A549、H1299和H226细胞的影响。A549和H1299作用于厚朴酚及厚朴总酚48h后，细胞活力随着浓度增加而减弱，且具有浓度依赖性。
　　2.厚朴酚及厚朴阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡。
　　接着我们考察厚朴酚及厚朴总酚对细胞周期和凋亡的影响。厚朴酚及厚朴总酚使A549和H1299阻滞在G0/G1期，使H226细胞阻滞在S期。此外，随着厚朴酚及厚朴总酚浓度的增加，能显著诱导A549和H1299细胞的凋亡。
　　3.厚朴酚及厚朴总酚抑制非小细胞肺癌细胞Ⅰ型HDACs的蛋白表达和功能
　　厚朴酚及厚朴总酚能显著抑制细胞活性和诱导细胞凋亡，为了进一步探索其机制，检测其对细胞核内Ⅰ型HDACs的影响。与对照组相比，厚朴酚及厚朴总酚能显著下调HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8的蛋白水平，且具有浓度依赖性。但厚朴酚及厚朴总酚不能影响Ⅰ型HDACs基因水平。
　　4.厚朴酚及厚朴总酚激活TRAIL通路诱导细胞凋亡
　　厚朴酚及厚朴总酚抑制Ⅰ型HDACs，考察其是否可以激活TRAIL通路，影响下游关键蛋白。厚朴酚及厚朴总酚使DR5的基因水平上调。相对于对照组，厚朴酚及其厚朴总酚能显著增加凋亡蛋白Bax的水平，同时，降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。
　　5.厚朴酚及厚朴总酚部分依赖抑制Ⅰ型HDACs诱导细胞凋亡
　　采用Western blot和流式细胞仪考察厚朴酚及厚朴总酚诱导的凋亡是否依赖于Ⅰ型去乙酰化酶。厚朴酚及厚朴总酚通过Ⅰ型HDACs诱导细胞凋亡，但不是唯一机制。同时，厚朴酚及厚朴总酚通过抑制Ⅰ型HDACs可使DR5基因的启动子区域的H3K27位点高度乙酰化。
　　6.厚朴酚及厚朴总酚抑制Ⅰ型HDACs而发挥抗肿瘤活性
　　通过免疫荧光检测体内肿瘤细胞的凋亡率，结果显示，厚朴酚及厚朴总酚诱导的凋亡细胞明显较对照组多。同时，厚朴酚及厚朴总酚增加DR5、Bax、caspase3、 cleaved caspase3、 cleaved PARP和caspase8的蛋白水平，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表达。
　　7.厚朴酚及厚朴总酚预防肺癌的发生和发展
　　与空白对照组相比，厚朴酚及厚朴总酚能有效的减少肺部结节，且无明显毒性，可以作为预防药物长期给药。
　　结论：
　　本研究证实厚朴酚及厚朴总酚作为Ⅰ型HDACi，阻滞细胞周期和激活TRAIL通路诱导细胞凋亡而发挥抗肺癌作用。
　　1.厚朴酚和厚朴总酚对A549、H1299、H226细胞有较强的抑制作用，其中，对A549和H1299细胞的抑制最强，且可以诱导A549和H1299细胞的凋亡。
　　2.厚朴酚及厚朴总酚抑制Ⅰ型HDACs（HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC8的蛋白水平。同时，通过是组蛋白和非组蛋白乙酰化，增加AC Histone H3、ACHistoneH4、AC p53和AC p65的蛋白水平。
　　3.厚朴酚和厚朴总酚通过下调G0/G1期关键蛋白cyclin D1使A549和H1299阻滞在G0/G1期。
　　4.厚朴酚及厚朴总酚能作为Ⅰ型HDACi激活TRAIL通路诱导A549和H1299的细胞凋亡，但不是其诱导凋亡的唯一机制。
　　5.厚朴酚和厚朴总酚通过抑制Ⅰ型HDACs抑制A549异移植瘤的生长而发挥抗肿瘤作用。在体内，厚朴酚和厚朴总酚可以通过TRAIL通路诱导体内肿瘤细胞的凋亡。在化学诱导肺癌模型中，厚朴酚及厚朴总酚能预防肺癌的发生和发展。

目录

摘要

第一章 前言

1．1 肺癌研究概况

1．2 肺癌与表观遗传学的研究

1．3 组蛋白去乙酰化与肺癌的研究

1．3 HDACi与肺癌的研究进展

1．4 HDACi与细胞凋亡的研究

1．5 HDACi与细胞周期的研究

1．6 厚朴酚与厚朴总酚的抗肿瘤研究

1．7 本文研究内容和意义

第二章 厚朴酚及厚朴总酚抑制NSCLC细胞的增殖

2．1 引言

2．2 材料和方法

2．3 实验结果

2．4 小结与讨论

第三章 厚朴酚及厚朴总酚对NSCLC细胞周期和凋亡的影响

3．1 引言

3．2 材料和方法

3．3 实验结果

3．3 小结与讨论

第四章 厚朴酚及厚朴总酚对Ⅰ型HDACs基因和蛋白表达的影响

4．1 引言

4．2 材料和方法

4．3 实验结果

4．3 小结和讨论

第五章 厚朴酚及厚朴总酚作为HDACi阻滞细胞周期和诱导凋亡的分子机制

5．1 引言

5．2 材料和方法

5．3 实验结果

5．4 小结和讨论

第六章 厚朴酚及厚朴总酚在体内的抗肺癌作用与机制

6．1 引言

6．2 材料和方法

6．3 实验结果

6．4 小结与讨论

第七章 结论与展望

7．1 结论

7．2 展望

参考文献

英文缩略词对照表

论文发表情况

致谢

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