TRAF2和RIP1介导的JNK激活诱导的自噬存活通路降低TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的机制研究

摘要

目的:本课题以体外培养的多种肿瘤细胞为研究对象，通过TRAIL进行干预，观察TRAIL能否诱导肿瘤细胞自噬以及自噬在TRAIL诱导肿瘤细胞自噬中的作用，并从细胞信号传导通路及蛋白水平探讨TRAIL诱导自噬以及自噬对不同肿瘤细胞增殖、凋亡影响的作用机制。为增强TRAIL的疗效以及逆转TRAIL的耐药肿瘤奠定实验理论基础。
　　 方法:应用TRAIL处理体外培养的UM-UC-3、A549以及PC-3，然后应用LDH检测TRAIL细胞毒性，应用Westernblot检测自噬相关蛋白，通过荧光显微镜检测自噬体的变化明确TRAIL能否诱导自噬。然后应用自噬抑制剂WTM、CQ以及沉默自噬关键基因ATG7以及Beclin-1抑制自噬观察对TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的影响，探明自噬在TRAIL诱导凋亡中的作用。应用Western blot检测凋亡信号通路蛋白Caspase8、Caspase3以及PARP的变化;应用自噬抑制剂CQ抑制自噬检测对TRAIL诱导死亡复合体的影响，应用GST Pull Down检测死亡复合体蛋白Caspase8、FADD以及RIP1表达的变化，明确自噬对凋亡和死亡复合体的影响。应用JNK抑制剂SP、NF-kB抑制剂IKBKB Inhibitor抑制JNK及NF-kB信号通路，观察其对自噬以及TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的影响，应用Western blot检测自噬相关蛋白LC-3B以及凋亡信号通路蛋白Caspase8、Caspase3以及PARP的变化，探明调节自噬的信号通路。应用TRAIL处理体外培养的肿瘤细胞UM-UC-3以及A549，然后应用Western blot检测Bcl-2家族蛋白的表达，通过免疫共沉淀(Co-IP)检测Beclin1-Bcl2/Bcl-xl复合体的变化;以及抑制JNK和NF-kB通路对上述蛋白变化的影响，明确TRAIL诱导自噬的可能机制。应用JNK抑制剂SP、自噬抑制剂WTM抑制JNK及自噬信号通路，然后应用Western blot检测对抗凋亡蛋白家族表达的影响;然后再应用自噬抑制剂CQ、CathepsinB、溶酶体抑制剂MG-132、凋亡抑制剂z-VAD以及JNK抑制剂SP，观察其对TRAIL诱导的抗凋亡蛋白家族降解的影响，探明自噬对抗凋亡蛋白降解的影响。最后沉默RIP1以及TRAF2，观察其对自噬水平的影响以及对TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的影响，应用LDH检测肿瘤细胞死亡以及应用Western blot检测自噬蛋白LC-3Ⅱ表达的变化，探明JNK激活介导的TRAIL诱导自噬的上游信号通路。
　　 结果:TRAIL可以诱导膀胱肿瘤细胞UM-UC-3、肺癌细胞A549以及前列腺癌细胞PC-3自噬;主要表现为LC-3Ⅱ表达增加、“自噬潮”的形成以及自噬体的显著增加。TRAIL诱导的自噬对肿瘤细胞起保护作用，无论是应用药物抑制剂3MA、WTM或CQ还是沉默自噬关键基因ATG7或Beclin-1抑制自噬，均能显著增强TRAIL的细胞毒性。自噬可以抑制TRAIL诱导的凋亡信号通路，抑制自噬可增强TRAIL诱导的细胞凋亡，以及死亡复合体的形成。抑制JNK可以抑制自噬，进而明显增强TRAIL诱导的细胞毒性。TRAIL诱导的自噬主要通过Bcl-xl的降解以及 Bcl-xl-Beclin1复合体的分离来实现的;而抑制JNK可以抑制Bcl-xl的降解并可以促进Bcl-xl-Beclin1复合体的重新结合。JNK介导的自噬参与了抗凋亡蛋白的降解，抑制JNK或抑制自噬均能显著促进抗凋亡蛋白cIAP1、cIAP2、XIAP以及c-FLIP的降解。RIP1以及TRAF2调节JNK激活诱导自噬的产生。沉默RIP1以及TRAF2均能有效地抑制自噬，并能显著增强TRAIL诱导的细胞死亡。
　　 结论:TRAIL可以诱导多种肿瘤细胞产生保护性自噬;而RIP1和TRAF2介导的JNK激活是TRAIL诱导自噬的上游信号;Bcl-xl的降解以及Bcl-xl/Beclin1复合体的分离是TRAIL诱导自噬的主要机制。抑制JNK介导的自噬可能是提高肿瘤对TRAIL敏感性的一个新的切入点。

目录

声明

符号说明

摘要

前言

1．材料与方法

2．结果与结论

3．分析与讨论

参考文献

全文图片

全文结论

下一步实验计划

文献综述(一) TRAIL抗肿瘤及耐药机制的研究进展

文献综述(二) 自噬与膀胱肿瘤研究进展

致谢

攻读学位期间的科研情况简介