小分子化合物木脂素VB6通过激活JNK信号通路诱导肿瘤细胞凋亡和自噬的机制研究

摘要

[研究背景]
　　 恶性肿瘤的发病率越来越高，且涉及机体各个系统，成为危害人类健康的常见病。目前，恶性肿瘤的治疗仍然以手术治疗为主，辅以化疗、放疗、生物治疗的综合性治疗。近年来在肿瘤手术及放化疗不断发展的同时，分子靶向治疗，肿瘤免疫治疗也飞速发展。随着临床治疗的多元化，肿瘤患者的临床获益得到改善，生存时间明显延长。但是，在化疗的过程中有相当部分患者因为对化疗药物耐药或者难以耐受药物的毒副反应而不能维持长期缓解，寻求高效低毒的药物仍是肿瘤治疗研究的一个重要方向。
　　 黄荆子乙酸乙酯提取物(Evn-50)来源于黄荆子(FructusViticisNegundo)，其为马鞭草科牡荆属植物黄荆(VitexnegundoL.)的果实，黄荆子性温，味苦，具有除痰，行气，止痛，退热，治疗咳嗽，哮喘的功能，中医主要用于治疗慢性支气管炎，对咳，痰，喘有明显疗效[1]。Evn-50是黄荆子的主要毒性成分，属于新木脂素类化合物，同其他植物类木脂素化合相比，不需经过肠道细菌转化成动物木脂素肠内酯、肠二醇。本课题组前期对Evn-50抗恶性肿瘤的作用进行了较系统的体外和体内的试验研究，体外研究发现Evn-50具有较广谱的抗恶性肿瘤作用，在体外对多种恶性肿瘤细胞系诸如MCF7、ZR-75-1、MDA-MB-435S、MDA-MB-231、LNCaP、PC-3、COC1细胞均有明显的增殖抑制作用，荷瘤裸鼠模型的研究也表明，Evn-50同样具有显著的抑制乳腺癌，前列腺癌，肝癌模型和子宫颈癌生长的作用。研究发现Evn-50通过显著上调Bax/Bcl-2的比值，促进Bax的表达，抑制Bcl-2的表达而诱导细胞发生凋亡。上述实验结果提示，天然小分子化合物Evn-50对多种恶性细胞具有明确的诱导凋亡作用。
　　 VB6又名6-羟基-4-(4-羟基-3-甲氧基苯基)3-羟甲基-7-甲氧基-3，4-二氢(3R，4S)-2-醛基萘，是从Evn-50化合物中分离纯化出来的单体分子。本课题组继续对VB6进行抗肿瘤活性研究，探讨VB6体外体内抗肿瘤作用及其可能机制，进一步从分子水平明确VB6对肿瘤相关信号通路的影响，为后续新型抗肿瘤药物的研发奠定实验基础。
　　 [研究目的]
　　 筛选敏感细胞株，研究VB6在体外对肿瘤细胞的增殖抑制及促进凋亡、自噬作用，并探讨其分子机制，明确其诱导肿瘤细胞发生凋亡、自噬的信号转导途径。同时建立大肠癌细胞株RKO裸鼠荷瘤模型，研究VB6的体内抗肿瘤作用。
　　 [研究方法]
　　 1.倒置显微镜观察VB6处理MCF-7、RKO细胞后的形态学改变；
　　 2.采用MTT法测定VB6对不同细胞株的生长抑制率，筛选敏感细胞株；
　　 3.透射电镜观察VB6处理MCF-7、RKO细胞后细胞凋亡、自噬形态改变；
　　 4.流式细胞仪分析凋亡细胞百分比及细胞周期改变；
　　 5.WesternBlot法检测VB6处理MCF-7、RKO细胞后JNK、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun、Bcl-2、Bax、p-Bcl-2、Caspase-3、PARP、Beclin-1、LC3B的表达变化；
　　 6.Balb/c-nu雌性裸鼠荷瘤，腹腔给药观察VB6的体内抗肿瘤作用。
　　 [研究结果]
　　 1.VB6对MCF-7和RKO细胞增殖抑制效果随着药物作用时间延长和浓度增加而加强
　　 应用倒置显微镜观察VB6对MCF-7和RKO细胞增殖的影响，经过5μMVB6作用不同时间后，两株细胞均可见细胞质减少，细胞体缩小，多数细胞由多边形变成椭圆形或者圆形，细胞伸展不良，逐渐与周围的细胞脱离，还有明显的空泡化，出现大量的细胞碎片，且形态改变随作用时间的延长而变得明显，不同浓度VB6对MCF-7和RKO细胞分别作用24、12小时后发现两株细胞产生同样的形态改变，高浓度更明显。结果表明VB6对MCF-7和RKO细胞增殖都有较好的抑制作用，并且抑制效果表现出时间和浓度依赖性。
　　 2.不同类型的细胞株对VB6的敏感性不同
　　 人乳腺癌MCF-7细胞株IC50为1.46μM，人白血病K562细胞株IC50为1.32μM，人大肠癌RKO、SW480、SW620细胞株IC50分别为2.85μM、4.2μM、3.36μM，人膀胱癌HTB-95637、RT4细胞株IC50分别为2.85μM、3.92μM，人骨肉瘤MG63细胞株IC50为2.01μM，人肺癌H1975细胞株IC50为4.24μM，人肝癌HepG2细胞株IC50为12.37μM，人胰腺癌Panc-1细胞株IC50为7.62μM，人胃癌细胞株AGS、MKN-28细胞株IC50分别为2.34μM、7.08μM，人前列腺癌PC-3细胞株IC50为1.71μM。
　　 3.VB6诱导MCF-7、RKO细胞出现凋亡和自噬形态改变
　　 5μMVB6作用MCF-7、RKO细胞24h后透射电镜观察结果显示：细胞胞体体积缩小，胞质浓缩，线粒体空泡化，核内染色质浓缩，形成染色质块，核碎片明显，两株细胞都出现了凋亡性死亡；透射电镜下除见到凋亡改变外，还可观察到细胞自噬的特征变化，可见双层膜结构的自噬泡积聚及膨胀的线粒体。
　　 4.VB6诱导MCF-7、RKO细胞凋亡呈浓度依赖性
　　 流式结果显示：VB6可以引起MCF-7和RKO细胞凋亡，并且细胞凋亡率呈浓度依赖性。MCF-7细胞经过1、2μMVB6处理细胞24h后，细胞的凋亡率分别是(6.15±1.07)％、(11.06±0.5)％，结果与对照组相比(p<0.05)。
　　 RKO细胞对照组凋亡率为2.51％，而经过1、5μMVB6处理细胞12h后，细胞凋亡率分别为10.75％、13.32％，结果同对照组相比均具有统计学差异(p<0.05)。
　　 VB6联合应用JNK特异性抑制剂SP600125处理MCF-7和RKO细胞相应时间后，两种细胞凋亡率明显受到抑制，同单用VB6相比，差异具有统计学意义。
　　 5.VB6可以引起MCF-7细胞G2/M期阻滞，并且细胞周期阻滞具有浓度依赖性
　　 应用流式细胞仪检测VB6对MCF-7和RKO细胞周期的影响，1，2μMVB6作用MCF-7细胞12小时G2/M期分别为17.51％、23.06％，明显高于正常对照细胞的4.89％，差异具有显著统计学意义(p<0.01)；且2μMVB6作用MCF-7细胞24小时G2/M期细胞比率增加到50.24％。而流式结果分析，VB6对RKO细胞周期分布未见明显影响。结果表明异VB6可以引起MCF-7细胞G2/M期阻滞，并且细胞周期阻滞具有时间和浓度依赖性。
　　 6.VB6通过引起Bcl-2和Bax表达变化，Caspase-3及PARP裂解激活，JNK通路活化诱导MCF-7和RKO细胞凋亡
　　 WesternBlot结果显示：VB6诱导乳腺癌MCF-7和大肠癌RKO细胞凋亡伴有Bcl-2和Bax相对比例的改变，RKO细胞Caspase-3及PARP裂解激活；VB6能以浓度和时间依赖性方式上调MCF-7和RKO细胞p-JNK、p-c-Jun、p-Bcl-2蛋白质的表达水平而引起细胞凋亡。VB6联合应用JNK特异性抑制剂SP600125处理MCF-7和RKO细胞后明显抑制p-JNK、p-e-Jun、p-Bcl-2蛋白质的表达水平，细胞凋亡比率受到明显抑制。
　　 7.VB6诱导MCF-7和RKO细胞自噬同自噬蛋白Beclin-1、LC3B有关
　　 Beclin-1的激活可以促进自噬的发生，LC3B是酵母Atg8的同源物，是哺乳动物细胞自噬体形成的可靠标志。通过Westernblot方法检测，结果显示VB6可上调两株细胞Beclin-1的表达，同时伴随有LC3B的裂解，呈时间依赖性。
　　 8.VB6对荷瘤裸鼠移植瘤生长的影响
　　 VB6对RKO细胞裸鼠移植瘤体积增长有抑制作用，同PBS组比较差异有显著性(p<0.05)，但VB6各浓度组间RKO细胞裸鼠移植瘤体积无统计学差异；同时，各浓度VB6组裸鼠体重、精神状态及尸检时裸鼠肝脏、肺脏、心脏、肠等重要脏器颜色、形状未见明显异常，实验剂量下VB6对裸鼠未见明显毒副作用。
　　 [结论]
　　 1.VB6能有效抑制多种人源性肿瘤细胞增殖，具有明显的细胞毒性作用，但细胞株类型不同，其敏感性不同；
　　 2.VB6能诱导MCF-7和RKO细胞凋亡，并且细胞凋亡率具有时间和浓度依赖性。能将MCF-7细胞周期阻滞在G2/M期；
　　 3.VB6能诱导MCF.7和RKO细胞自噬性死亡；
　　 4.VB6通过显著上调Bax/Bcl-2的比值，促进Bax的表达，抑制Bcl-2的表达而诱导细胞发生凋亡；
　　 5.VB6通过激活JNK信号通路抑制MCF-7和RKO细胞增殖和诱导细胞凋亡；
　　 6.VB6对RKO细胞Balb/c-nu裸鼠移植瘤体积增长有一定的抑制作用，并且实验剂量下VB6对裸鼠未见明显毒副作用。