RhoA激酶1在氧化低密度脂蛋白诱导足细胞损伤中的作用

摘要

慢性肾脏疾病(CKD)在中国普通人群患病率高达11.8％-13.0％，与之相应，中国每年新增肾脏替代治疗患者人数不断攀升，如何延缓CKD患者肾功能进展成为亟需解决的难题。近年研究证明脂质异常是公认的促进CKD持续进展的独立危险因素。随着高脂血症发生率的增加，脂质对肾脏的不良影响，特别是对合并CKD患者肾毒性日益受到重视。深入研究脂质肾脏损伤的分子机制不仅可以加深对脂质肾毒性的理论认识，也有助于获得防治和延缓CKD持续进展的新思路。
　　1982年，Moorhead提出“脂质肾毒性”假说:肾小球病变所引起的高脂血症和蛋白尿会导致肾脏疾病持续的进展，而且脂质的异常会同时造成动脉粥样硬化和肾小球硬化的形成，肾小球硬化和动脉粥样硬化是一系列相互存在联系的临床疾病中的一部分。我们的实验通过体外培养的小鼠肾小球足细胞首次发现，小鼠足细胞表达ROCK1，ox-LDL(oxidized low-density lipoprotein)刺激能调节足细胞上ROCK1的活性并使裂孔膜蛋白nephrin的表达下降。这个结果表明肾小球足细胞也许通过提高ROCK1的活性来参与脂质肾脏损伤。但有关ox-LDL介导足细胞损伤的具体调控机制，尚未得到深入的研究。
　　Rho激酶(ROCK)是RhoA下游最为重要的效应分子之一，它是一种丝氨酸-苏氨酸激酶，有ROCK1和ROCK2两个异构体，可以被GTP结合蛋白RhoA激活（与GTP结合时被激活，与GDP结合时失活），激活的ROCK可以使其底物如肌球蛋白轻链、LIM激酶、埃兹蛋白-根蛋白-膜突蛋白、肌球蛋白磷酸化亚单位(MYPT)等磷酸化，在细胞收缩、中性粒细胞迁徙、神经细胞生长发育和细胞凋亡过程中发挥极为重要的作用。有实验表明通过抑制ROCK的表达可以增加自噬小体的体积，进而促进自噬的发生。另外有研究显示在体外使用ROCK抑制剂Y-27632可以显著增加细胞蛋白分解、减少异常蛋白质的积聚，也可以激活细胞内的其他蛋白酶如泛素蛋白酶系统，增加自吞噬作用，促进细胞的异常增多的物质的消化和分解。
　　目的:
　　本研究是通过在体外实验建立ox-LDL诱导的足细胞脂质损伤模型，来观察ox-LDL对小鼠足细胞ROCK1活性及nephrin表达的影响;并且通过使用ROCK1siRNA和wt ROCK1质粒来双向调节ROCK1来探讨ROCK1对足细胞摄取脂质、足细胞胆固醇含量的影响以及nephrin、LC3-Ⅱ、P62、p-ULK1(Ser757)表达的关系，初步来探讨ROCK1参与脂质肾脏损伤的发病机制。
　　方法:
　　一、小鼠的足细胞培养、鉴定以及处理分组
　　（一）小鼠的足细胞培养方法
　　永生化条件下的足细胞(MPC)复苏后，使用含10％FBS的RPMI-1640培养基和20-100U/mL重组的小鼠γ干扰素在5％CO2，在33℃条件下诱导增殖和传代。后续转入5％CO2，37℃培养箱分化等待成熟。
　　（二）小鼠足细胞形态学的观察以及鉴定
　　将33℃的培养箱和37℃的培养箱中的足细胞在倒置相差显微镜下拍片，并观察比较两者之间的形态学差异;采用足细胞特异性骨架蛋白synaptopodin免疫染色来确定足细胞是否已经分化成熟了，成熟的足细胞表达并且延着细胞骨架清晰分布。
　　（三）成熟足细胞的处理分组
　　(1)Ox-LDL刺激对足细胞ROCK1活性影响
　　(2)调控ROCK1的表达对p-MYPT/MYPT、nephrin等表达、足细胞摄取脂质，细胞胆固醇浓度的影响
　　检测内容
　　使用酶法检测足细胞胆固醇含量;Western Blot检测p-MYPT/MYPT、Nephrin、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅱ等的蛋白表达水平;使用免疫荧光的方法来检测足细胞中脂质的变化情况。
　　四、统计学分析
　　计量资料数据以均数±标准差((x)±SD)表示，采用SPSS20.0统计软件进行统计学分析。多组间结果比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)方法。
　　结果:
　　与正常对照组相比，ox-LDL刺激上调足细胞ROCK活性增加（p-MYPT表达升高），同时伴有nephrin、LC3-Ⅱ表达下降(p＜0.05)，P62、p-ULK1表达上升（p均＜0.05），细胞内胆固醇含量增加(p＜0.05);抑制ROCK1表达能抑制ox-LDL诱导的p-MYPT水平上调，同时上调nephrin、LC3-Ⅱ的表达(p＜0.05)，下调P62、p-ULK1的表达（p均＜0.05），降低细胞内胆固醇含量(p＜0.05);与之相反，增加ROCK1表达能进一步增加ox-LDL诱导的p-MYPT水平，并进一步降低nephrin、LC3-Ⅱ的表达，增加P62、p-ULK1的表达(p均＜0.05)和细胞内胆固醇含量(p＜0.05)。
　　结论:
　　ROCK1介导的脂质自噬障碍是ox-LDL诱导足细胞损伤的重要途径。

目录

摘要

引言

材料与方法

2．主要试剂

3．主要仪器

4．永生化条件下小鼠足细胞的培养，诱导和鉴定

5．足细胞的试验分组及药物干预

6．免疫荧光及激光共聚焦显微镜下鉴别足细胞和验证足细胞表达ROCK1

7．ROCK1 siRNA和wt ROCK1质粒的转染

9．Western blot

10．胆固醇含量测定

11．DiI-Ox-LDL摄取

12．统计学处理

结果

一．足细胞增殖、分化成熟状态形态学比较及特异性鉴定

五． 调控ROCK1的表达对细胞内胆固醇含量的影响

六．调控ROCK1的表达对LC3-Ⅱ及P62表达的影响

八．调控ROCK1对足细胞摄取脂质的影响

讨论

结论

参考文献

中英文缩略词表

研究成果

致谢

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