利用黑水虻幼虫制备胰蛋白胨的工艺研究

摘要

黑水虻学名亮斑扁角水虻(Hermetia illucens L.)，是双翅目水虻科扁角水虻属昆虫，幼虫营腐生性。黑水虻抗逆性强、易养殖，且幼虫（干燥）蛋白和油脂含量较高，可用于抗菌肽提取、壳聚糖制备、护肤品开发、生物柴油转化等研究。目前，黑水虻在中国南方很多地区已广泛养殖，具有良好的市场开发前景。
　　蛋白胨（Peptone）是动物植物蛋白经过酸、碱或者酶水解而得到的一种由（蛋白质与蛋白胨的中间产物之一）、胨、肽、氨基酸为主要成分的水溶性混合物。1880年Naegeli首次将蛋白胨在细菌培养中进行应用并获得更为显著的培养效果之后，蛋白胨便成为微生物培养、分离和鉴定的主要营养氮源，也是检测、发酵、医药、免疫等相关研究不可或缺的生化试剂。
　　本课题以黑水虻幼虫为原料，经干燥、粉碎、脱脂后采用酶解的方式进行加工。采用索氏抽提法对黑水虻幼虫（干燥）进行脱脂处理，并确定最佳的提取有机试剂及抽提时间。以水解产物上清液中氨基态氮含量为指标，确定加工中合适的蛋白酶、缓冲液及其浓度。单因素（缓冲液pH值、水解温度、胰蛋白酶添加量、水解时间、底物添加量）试验确定合适的水平，五因素四水平设计L16(45)正交试验以对水解工艺优化，得到最佳的黑水虻脱脂蛋白粉水解实验条件。水解产物经离心取上清液，真空冷冻干燥、粉碎后获得蛋白胨。通过理化指标分析和微生物测试，与市场上购买的商品胰蛋白胨产品进行对比。
　　研究结果如下：
　　（1）丙酮相对乙醚及石油醚更适合黑水虻脱脂，最佳提取时间为6 h。胰蛋白酶相对于木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶而言，水解黑水虻脱脂蛋白粉的效果最理想，结果差异极显著，产物中氨基氮含量分别是以上蛋白酶的15.68、8.43、20.12、6.50倍。进一步实验结果显示，使用0.025 mol/L浓度的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液对胰蛋白酶水解黑水虻脱脂蛋白粉的效果达到最优，其产物上清液氨基态氮含量为1.21 g/100mL；
　　（2）通过胰蛋白酶水解黑水虻脱脂蛋白粉的单因素试验结果，确定因素中的水平范围为：NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液pH值(7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)，水解温度(45、50、55、60℃)，胰蛋白酶添加量(4000、5000、6000、7000 U/g)，水解时间(3.0、3.5、4.0、4.5 h)，底物添加量(5、10、15、20 w/v)；
　　（3）经正交试验优化后结果显示，pH7.5、水解温度50℃、酶添加量4000 U/g、水解时间为4.5 h、底物浓度为15 w/v时，产物上清液氨基态氮含量为2.03 g/100mL；经正交试验均值分析，pH7.5、水解温度55℃、酶添加量7000 U/g、水解时间为4.5 h、底物浓度为15 w/v为各因素的最佳水平，此条件下产物上清液氨基氮含量为2.74 g/100mL；
　　（4）以优化后的方案经真空冷冻干燥后粉碎制备的产物上清粉，经检验：水分含量5.25%、灰分含量6.73%、氨基氮含量8.11%、总氮含量13.56%、2%水溶液的pH6.78，大肠菌群阴性。上清液中检测到17种氨基酸，脯氨酸未检测出。其中，谷氨酸、亮氨酸、赖氨酸、丙氨酸、精氨酸、缬氨酸含量均超过5.00%，上清液氨基酸含量达90.05%，必需氨基酸占50.14%；
　　（5）以产物上清粉作为蛋白胨，替代市场上购买的蛋白胨配置改性牛肉膏蛋白胨培养基和LB培养基，经微生物生长试验表明，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌在改性液体培养基培养，菌体浓度高；在固体改性培养基上生长圈直径显著优于对照试验组，因此，产物上清粉可替代市场上的胰蛋白胨，相关指标亦满足HK/QW-SJS-35胰蛋白胨的质量标准。
　　结论：本研究说明黑水虻可作为制备蛋白胨的原料，其理化指标满足行业质量标准。合理，易于操作，方便进行相关产品推广。

目录

声明

符号说明

1 前言

1.1 黑水虻

1.2 蛋白质的水解

1.3 蛋白胨

1.4 本课题研究意义和主要内容

2.1实验材料

2.2 实验方法

3.1 索氏抽提法制备黑水虻脱脂蛋白粉

3.2 蛋白酶对黑水虻脱脂蛋白粉水解的影响

3.3 缓冲液对胰蛋白酶酶解黑水虻脱脂蛋白粉的影响

3.4 NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液的浓度对胰蛋白酶水解的影响

3.5 胰蛋白酶水解黑水虻脱脂蛋白粉单因素试验

3.6 胰蛋白酶水解黑水虻脱脂蛋白粉正交试验

3.7 产物分析

3.8 水解上清粉应用效果

4.1讨论

4.2 结论

5 研究后续深入及改进之处

致谢

参考文献

附录