酶解金枪鱼头蛋白制备抗氧化活性肽的研究

摘要

金枪鱼是名贵海洋鱼类,大多作为罐头加工或制作生鱼片,加工过程中产生的下脚料鱼头、内脏,鱼骨和鱼皮等约占总重量的50％～70％。金枪鱼头蛋白含量丰富,营养价值高,是一种优质的蛋白源,是开发功能食品的优质原料。
　　 本论文以大眼金枪鱼头作为原料,采用酶解法、比色法、超滤、凝胶层析、高效液相色谱等方法,研究了酶解工艺的主要参数、酶解物体外体内抗氧化活性、抗氧化肽的分离纯化等内容,取得的主要研究结果如下:
　　 1、以干基计,大眼金枪鱼头蛋白质含量为63.33％,粗脂肪含量为16.72％,是一种高蛋白、高脂肪且氨基酸组成合理的优质蛋白资源。采用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、Alcalase2.4L、Typsin和Pepsin五种常用蛋白酶分别酶解金枪鱼头,以酶解产物对羟基自由基的清除活性为指标,得到Alcalase2.4L酶解产物的活性最高,在酶解6h时清除率最大为59.44％；在单因素试验结果基础上,根据Box—Behnken的实验设计原理,设计三因素三水平的中心组合实验,考察温度、加酶量和酶解时间对羟基自由基清除率的影响,优化酶解条件为:酶解时间340min、温度54℃、加酶量为0.38％和自然pH,得到酶解产物的羟基自由基清除率为63.67％。
　　 2、采用多种抗氧化体系评价了优化酶解条件下制备的酶解物抗氧化活性。酶解物的还原力随蛋白浓度的增加而增加,在2.5mg/mL-12.5mg/mL浓度范围内,二者呈良好的线性关系(R2=0.9997)；酶解物对超氧阴离子有较高清除能力,在浓度为5mg/mL时,清除率可达84.72％,IC50值为1.20 mg/mL；酶解物对DPPH自由基的清除率随蛋白浓度增加而增加,在浓度为2mg/mL时,清除率可达57.80％,IC50值为1.34 mg/mL；在磷脂卵黄体系中,酶解物能有效抑制金属离子诱导的脂质过氧化反应,其抗脂质过氧化能力略低于对照GSH,在5mg/mL时,酶解物对脂质过氧化的抑制率为51.21％,IC50值为4.98mg/mL；在热诱导大豆油的氧化体系中,不同浓度的酶解物对大豆油氧化抑制作用有显著性差异(p<0.05),0.1％酶解物和0.01％BHT的抑制脂质过氧化能力相当(p>0.05)。高校液相色谱分析酶解物的分子量分布,结果表明酶解物主要由分子量3KDa以下的肽组成,比例为59.66％,其中有将近40％的低聚肽。
　　 3、采用截留分子量为8KDa、5KDa、3KDa和1KDa的超滤膜对金枪鱼头蛋白酶解物进行初步分离,得到五个超滤组分,对各组分清除羟基自由基能力进行测定,活性最高的为组分Ⅴ(<1K),其对·OH的IC50值为1.38mg/ml；活性最低的为组分Ⅰ(>8K),IC50值为3.15 mg/ml。对组分Ⅴ的其他抗氧化活性研究表明:组分Ⅴ的还原力随着添加量增加而增加,略低于酶解物:对超氧阴离子、DPPH自由基有较好的清除能力,IC50分别为0.73 mg/ml和0.93mg/ml；对卵黄磷脂氧化和大豆油的热诱导氧化都有显著的抑制作用,0.1％的组分Ⅴ和0.01％的BHT效果相当,能有效延缓油脂的氧化。
　　 4、采用Sephadex G-25葡聚糖凝胶对组分Ⅴ进行层析分离,组分Ⅴ被分成四个峰,峰Ⅰ分子量分布为1611Da～711Da；峰Ⅱ的分子量介于267Da～82Da之间,峰Ⅲ为游离氨基酸,峰Ⅳ可能是一些杂质产生的吸收。与酶解物和组分Ⅴ相比,峰Ⅰ和峰Ⅱ的对·OH清除活性有显著提高,IC50值分别为0.929 mg/ml和0.527 mg/ml,峰Ⅲ的羟基自由基清除活性较低,IC50值为1.65mg/ml。分析峰Ⅰ和峰Ⅱ的氨基酸组成表明,峰Ⅰ中87.12％的氨基酸都是以肽的形式存在的,其中Glu、Gly、Ala、Leu和Lys含量高；峰Ⅱ中Tyr、Phe、Leu和Met含量较高,推测可能与其抗氧化活性有关。
　　 5、通过动物实验考察了组分Ⅴ对D-半乳糖损伤小鼠的抗氧化活性。结果表明:与模型组比较,组分Ⅴ能改善D-半乳糖损伤小鼠的精神状态,对小鼠的体重无显著影响；低剂量组能提高小鼠的胸腺指数(p<0.05),对小鼠的肝脏和脾脏指数无显著影响,显著升高D-半乳糖损伤小鼠肝脏中SOD活性(p<0.05)；高剂量组和低剂量组均显著升高D-半乳糖损伤小鼠血清和肝脏的GSH-Px活性(p<0.05)；高剂量组、低剂量组血清中MDA含量显著降低。