金枪鱼头酶解物免疫活性肽的分离及对小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响

摘要

金枪鱼是名贵海洋鱼类，因其营养丰富味道鲜美，一直被公认为最理想的健康食品。鱼头是金枪鱼产业化加工下脚料的主要组成部分，其蛋白质含量高，氨基酸组成合理，是制备开发生物活性肽的理想原料。本实验室长期开展金枪鱼头高值化利用的研究，已有实验结果证明，黄鳍金枪鱼头蛋白酶解液10-5KDa组分具有增强小鼠免疫功能的作用。本研究在此基础上对金枪鱼头蛋白酶解物10-5KDa组分进行了营养学评价和理化性质分析，采用葡聚糖凝胶层析法对免疫活性肽进行了分级分离，研究了活性组分对小鼠腹腔巨噬细胞免疫功能的影响。旨在寻求免疫活性肽的分级分离条件，为探讨其增强免疫作用机理以及开发利用提供理论基础。主要研究结果如下：
　　利用超滤法从金枪鱼头蛋白酶解液中制备10-5KDa组分TIP，对TIP的营养学和理化性质进行了较系统的分析。TIP的粗蛋白含量高达86.1％，脂肪含量0.86％，含有人体必需的矿物质元素钾、钠、镁、钙、磷和微量元素铁、锌、铜、硒。氨基酸组成合理，总氨基酸含量为5.15g/100mL，其中必需氨基酸占36.28％，鲜味氨基酸占48.12％。分子量分布结果显示TIP中存在多种分子量的片段，其中10～5KDa的组分占27.49％，3.6～1.4KDa之间的占40.93％，1KDa以下有18.20％。采用氮溶指数(NSI)对TIP的溶解性进行评价，结果显示TIP有着优良的溶解性，在pH2～pH12范围内、30～85℃温度范围内，NSI均达到0.9以上。TIP乳化性一般，起泡性良好，在蛋白浓度为3％时，发泡性达到最高值为1.60，发泡稳定性偏低，但在pH10时，显著增强。
　　采用葡聚糖凝胶Sephadex G-25对TIP进行了初步分离，确定了最佳分离条件：柱规格2.6×60cm流速0.5mL/min，上样量为20mg/mL×5mL，此条件下TIP可以分为TIP1，TIP2，TIP3，TIP4和TIP5五个部分。通过小鼠体外脾淋巴细胞增殖实验对分离组分进行免疫活性跟踪，证实组分TIP3的中剂量(0.2mg/mL)、低剂量(0.01mg/mL)组可显著促进小鼠脾淋巴细胞增殖(P<0.05)，有较好的活性。对TIP3采用SephadexG-15做进一步分离纯化，得到三个洗脱峰，对主要组分TIP3B，TIP3C进行氨基酸分析和电喷雾质谱分析，结果显示 TIP3B肽含量约占86％，主要由200-1200Da的肽段组成。TIP3C组成成分复杂，肽含量约占74％，主要由分子量200-800Da的小肽构成。经脾淋巴细胞增殖活性测定显示，TIP3C在浓度为0.05mg/mL时，可以显著促进小鼠体外脾淋巴细胞的增值(P<0.05)。
　　考察了组分TIP3C对小鼠腹腔巨噬细胞免疫功能的影响。用MTT比色法和吞噬中性红法考察了TIP3C对小鼠腹腔巨噬细胞代谢活性和吞噬功能的影响；采用Griess法和ELISA法检测了TIP3C对小鼠腹腔巨噬细胞释放一氧化氮(NO)，诱导细胞因子TNF-α、IL-6产生的影响。结果显示TIP3C高(0.04mg/mL)、中(0.02mg/mL)、低(0.01mg/mL)剂量组均对小鼠腹腔巨噬细胞代谢活力有增强作用(P<0.05)，其活性与阳性对照0.02mg/mL脂多糖相当；低剂量组可以明显增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能(P<0.05)，且活性显著大于阳性对照0.02mg/mL脂多糖(P<0.05)。TIP3C刺激小鼠腹腔巨噬细胞释放NO、TNF-α、IL-6的量高于阴性对照组，但均无显著性差异(P>0.05)