利用罗非鱼下脚料生产抗菌营养复合型活性肽的工艺研究

摘要

每年，我国水产加工行业产出的罗非鱼下脚料数量巨大。罗非鱼下脚料中营养物质多样，富含蛋白质，是优质高效的动物蛋白质源。但是目前对罗非鱼下脚料的利用还处在落后阶段，只有少部分被加工咸鱼粉等低值产品，大部分被丢弃，造成了资源浪费的同时且加剧了对自然环境的污染。如何将这些宝贵的资源高值化利用起来，成为世界科学工作者们研究热点。
　　近年来，随着对饲用活性肽的深入研究，其越来越多的生理功能被发掘出来，显示出巨大的潜力和广阔的应用前景。抗菌脂肽和营养小肽作为饲用活性肽的重要成员，被认为是目前最具潜力的饲用抗生素替代品。但由于生产工艺复杂，产品成本高，污染排放大，产业化进展缓慢。若能将两者生产工艺合二为一，可以简化工艺，大幅度降低成本，且能实现生产零排放，从而突破高效产业化生产技术瓶颈。
　　针对以上存在的问题，本文拟利用罗非鱼下脚料作为主要的营养基质，加入一定量的麸皮和甘蔗渣作为通气的物质，接入纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）NT-6，进行固态发酵生产同时含脂肽和小肽的复合型活性肽饲料，优化了发酵条件和发酵基质，最大化抗菌脂肽的产量，探究了整个发酵过程中各参数指标的动态变化并以此为依据建立发酵动力学模型，接着对基质进行二次酶解并对酶解条件进行优化制得活性多肽，将酶解得到的多肽分离纯化，找出其中的活性肽并对其进行质谱检测，进而确定活性小肽的分子量及氨基酸序列，最后检测发酵终产物的各参数指标，评估产品品质。本研究内容及结果如下:
　　1.探究了罗非鱼下脚料与麸皮的配比、甘蔗渣添加量、初始基质水分含量、初始pH、接种体积、发酵温度及时间这七个因素对抗菌脂肽产量的影响，利用LC-MS法定量检测抗菌脂肽的产量，在单因素实验的基础上通过响应面设计进一步优化，得到最佳的发酵工艺参数，结果表明:罗非鱼下脚料与麸皮配比3.48∶1，时间61.69h，初始基质水分含量69.34％，温度28.97℃时，抗菌脂肽产量最高，达7.32g/kg。通过此优化，抗菌脂肽的产量得到了明显提高。
　　2.监测了整个发酵过程的各理化指标(pH、温度、水分)、抗菌脂肽含量、蛋白水解度、蛋白含量、菌体生长及酶活力等的动态变化，通过Origin软件对纳豆菌生长、蛋白消耗及脂肽生成的实验数据进行拟合，并以此为依据建立相应的发酵动力学模型，结果表明，得到的拟合方程R2均在0.98以上，拟合效果良好，此研究为我们将此工艺扩大化应用到实际生产中提供理论依据。
　　3.对发酵基质进行二次酶解，以水解度为衡量指标，探究温度、时间、pH及水料比对内源酶酶解蛋白程度的影响，单因素实验表明以上四种因素对水解度均有显著的影响，在此基础上采用响应面设计优化得到最佳的酶解工艺:温度48.56℃，pH7.43，水料比1.07∶1，时间8.29h，水解度达最大为37.56％，从而实现活性小肽产率最大化。
　　4.本试验对发酵酶解终产物中的有效成分进行了全面分析，包括营养小肽、抗菌脂肽和其他技术指标的测定。一方面利用超滤技术分离罗非鱼下脚料蛋白酶解液得到产物多肽液，分别检测各组分的自由基清除活性，其中以1000Da以下活性最高(56.85％)，再将这一组分通过SephadexG-25凝胶色谱技术进一步分离纯化，得到5个洗脱峰，分别为TPH-1、TPH-2、TPH-3、TPH-4和TPH-5，其中以TPH-4活性最强(70.58％)，后通过LC-MS/MS法测定TPH-4，最终确定TPH-4含有两种小肽，分子量分别为566.47和679.52，经分析其对应的氨基酸序列分别为Leu-Asn-Asp和Leu-Met-Leu-Leu;另一方面利用LC-MS法检测分析干燥终产物中抗菌脂肽的组成成分及含量，结果表明终产物中的抗菌脂肽主要含Surfactin(995.20，1008.20，1058.20)和Iturin(1044.30，1071.20)两类，另外还有很少量的Fengycin(1493.00)，含量达6.93g/kg;此外还测得终产物复合饲料中粗蛋白含量达32.13g/100g（干重），寡肽含量为12.09％，水解度达37.32％，益生菌纳豆菌数量为9.0×108cfu/g（干重），发酵前后蛋白质体外消化率、蛋白溶解度及必须氨基酸的含量均明显升高，产品品质得到显著提升。其中既富有抗菌脂肽，又含有活性小肽，有希望成为优质的饲料添加剂应用到生产中。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 罗非鱼下脚料

1．1．1 罗非鱼的生产情况

1．1．2 罗非鱼下脚料的利用现状

1．2 饲用活性肽

1．2．1 抗菌脂肽

1．2．2 营养小肽

1．3 本研究的目的意义、内容和创新之处

1．3．1 研究目的及意义

1．3．2 研究内容

1．3．3 研究创新之处

2 纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)NT-6固态发酵罗非鱼下脚料产抗菌脂肽工艺条件优化

2．1 材料与仪器

2．1．1 实验菌株

2．1．2 实验材料与试剂

2．1．3 主要仪器设备

2．2 试验方法

2．2．1 菌株活化及种子液的制备

2．2．2 发酵产物的制备

2．2．3 抗菌脂肽的提取及检测

2．2．4 单因素实验设计

2．2．5 响应面实验设计

2．3 结果与分析

2．3．1 单因素实验结果与分析

2．3．2 固态发酵产抗菌脂肽工艺参数优化

2．4 讨论

2．5 小结

3 固态发酵罗非鱼下脚料产抗菌脂肽发酵动力学研究

3．1 材料与仪器

3．1．1 实验菌株

3．1．2 实验材料与试剂

3．1．3 其他试剂

3．1．4 主要仪器与设备

3．2 试验方法

3．2．1 菌株活化及种子液的制备

3．2．2 发酵产物的制备

3．2．3 产物粗酶液的制备

3．2．4 固态发酵过程中各个指标的测定

3．3 结果与分析

3．3．1 发酵全程各参数指标的动态变化

3．3．2 发酵动力学模型分析

3．4 讨论

3．5 小结

4 二步酶解产活性肽条件优化

4．1 材料与仪器

4．1．1 实验菌株

4．1．2 实验材料与试剂

4．1．3 其他试剂

4．1．4 主要仪器与设备

4．1．5 菌株活化及种子液的制备

4．2 试验方法

4．2．1 酶解实验设计

4．2．2 水解度的测定

4．2．3 单因素实验设计

4．2．4 响应面法优化蛋白酶解条件

4．3 实验结果与分析

4．3．1 单因素实验结果及分析

4．3．2 响应面试验结果

4．3．3 回归模型的建立及方差分析

4．3．4 两因素相互作用图

4．3．5 最佳酶解参数及数据验证

4．4 讨论

4．5 小结

5 终产物中有效成分分析

5．1 材料与仪器

5．1．1 材料与试剂

5．1．2 主要仪器与设备

5．2 试验方法

5．2．1 罗非鱼下脚料酶解多肽液的制备

5．2．2 酶解多肽液的超滤

5．2．3 SephadexG-25凝胶柱纯化

5．2．4 LC-MS／MS法分析营养小肽

5．2．5 抗氧化活性的测定

5．2．6 罗非鱼下脚料饲料的制备

5．2．7 抗菌脂肽的检测

5．2．8 粗蛋白含量的测定

5．2．9 产物蛋白质体外消化率的测定

5．2．10 产物蛋白溶解度的测定

5．2．11 产物寡肽含量的测定

5．2．12 产物水解度的测定

5．2．13 产物中纳豆芽孢杆菌NT-6数量的检测

5．2．14 必需氨基酸含量的检测

5．3 结果与分析

5．3．1 产物中多肽组分分析

5．3．2 产物中抗菌脂肽组分分析

5．3．3 产物中其他技术指标的测定

5．4 讨论

5．5 小结

6 结论与展望

6．1 结论

6．2 展望

参考文献

致谢

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