乳酸菌复合系SFC-2的筛选及其秸秆发酵过程中的协同作用机理

摘要

农作物秸秆是一种重要的生物质资源。近几年来，由于农作物产量的大幅度提高和农民薪材结构的改变，越来越多的秸秆成为废弃物，既浪费了资源又污染了环境。因此，解决我国剩余秸秆问题对资源利用和治理地球环境污染极其重要。目前，对秸秆的综合利用大致有发展秸秆能源、秸秆饲料、秸秆肥料等方面。秸秆作为反刍动物的饲料是解决秸秆污染问题和给人类增加蛋白营养来源的重要途径，也符合我国畜牧业长远发展目标。但是，由于秸秆养分低，适口性差，消化率低，因而如何提高秸秆的适口性，提高饲用价值是解决我国秸秆公害、提高有机物利用率的一大热点。通过微生物发酵是提高秸秆适口性和饲用价值的重要途径之一。关于饲料化发酵，当前有接种单菌或简单人工混合接种等多种报道，但结果都不甚理想。 本研究旨在获得一组在不灭菌条件下能够抵制杂菌污染，稳定地、高效地促进作物秸秆饲料化发酵的微生物群体，摆脱传统的纯培养技术，以自然发酵物为菌源，通过“外淘汰法”长期定向限制性培养手段构建出一组pH下降迅速、乳酸产量高、对环境变化耐性强的乳酸菌复合系；结合分子生物学手段分析其组成多样性，将其接种到作物秸秆验证应用效果，并纯化分离其中的主要菌株研究其性质，进一步用定量PCR技术追踪了主要菌株在接种复合系的发酵体系中的动态。得出的结果如下： 用MRS-S培养基通过连续继代培养，得到一组乳酸菌复合系，它能在12h内将培养液的pH降至3.8，发酵产物主要为乳酸和乙酸，乳酸中以L-(+)乳酸居多，约占总乳酸生成量的64％，乳酸与乙酸的产生比率为4.63。通过传统平板分离和FISH、PCR-DGGE、克隆文库分析等现代分子生态学手段分析该复合系的组成，得出，组成菌主要为Lactobacillus．fermentum(发酵乳杆菌)(76.3％)、Lactobacillus plantarum (植物乳杆菌)(20.3％)、Lactobacillus paracasei (类干酪乳杆菌)(3.4％)，均为乳酸杆菌属(Lactobacillus．)。 将该复合系分别接种到玉米、水稻、小麦秸秆发酵，结果表明，接种在玉米秸秆中，发酵30d后，接种处理比对照pH降低7.36％，乳酸含量提高了174.79％；接种在稻秆中，接种处理比对照pH降低7.5％，乳酸含量提高了139.49％，经PCR-DGGE分析发酵过程中菌群动态，表明接种该复合系后，复合系中的主要组成菌L．plantarum，L．fermentum和L．paracasei迅速成为发酵料中的优势菌群，明显抑制了未接种对照中可见的多种杂菌，发酵品质得到明显改善。 为了进一步研究该复合系在接种发酵过程中的作用机制，将复合系、复合系的主要分离单菌株及分离单菌株的人工混合分别接种到稻秆发酵，用定量PCR方法监测主要组成菌L．plantarum， L.fermentum和 L.paracasei 在各处理中的消长动态，得出单纯接种分离单菌株L．fermentum SFCB2-li，可以促进发酵料中 L．plantarum和 L paracasei的增殖；L．fermentum和 L.plantarum菌株生长较快，在发酵前期逐渐增殖，后期逐渐衰退，而L．paracasei菌株生长较慢，在发酵后期占优势，保证了发酵过程中的乳酸菌量。

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论文说明：缩略词表

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第一章绪论

1.1农作物秸秆国内外利用现状

1.2秸秆饲料资源开发的重要意义

1.3微生物接种剂国内外研究进展

1.4分子生物学技术在微生物生态领域的应用

1.5研究内容和技术方案

第二章技术与方法

2.1培养基及培养条件

2.2乳酸菌复合系的构建

2.3总DNA的提取---氯苯法(benzyl chloride method)

2.4 PCR-DGGE及DGGE条带测序

2.5秸秆发酵实验设计

2.6秸秆发酵饲料营养价值评定

2.7定量PCR(REAL-TIME PCR)

2.8荧光原位杂交(FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDIZATION)

2.9统计学分析

2.10核苷酸序列的基因库登录号

第三章玉米、水稻、小麦干秸秆自然发酵过程中的生化变化

3.1结果与分析

3.2讨论

第四章乳酸菌复合系SFC-2的构建及其菌种组成多样性

4.1结果与分析

4.2讨论

第五章乳酸菌复合系SFC-2及其分离单菌株的生理生化特性

5.1结果与分析

5.2讨论

第六章乳酸菌复合系SFC-2对玉米、水稻、小麦秸秆的接种效果

6.1结果与分析

6.2讨论

第七章定量PCR监测L.FERMENTUM,L.PLANTARUM,L.PARACASEI菌株在稻秆发酵料中的消长动态

7.1结果与分析

7.2讨论

第八章乳酸菌复合系SFC-2和AL2对发酵材料的专一性

8.1结果与分析

8.2讨论

第九章主要结论与展望

9.1综合讨论

9.2创新点

9.3展望

参考文献

致谢

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