鲍鱼内脏蛋白肽的制备及其体外活性研究

摘要

利用鲍鱼内脏制备具有生物活性的蛋白肽，是实现鲍鱼资源综合利用的有效途径。本研究以鲍鱼内脏为原料，通过酶解、超滤制备蛋白肽，初步探讨鲍鱼蛋白肽分离组分和抗氧化活性之间的关系。然后，对鲍鱼蛋白肽进行分离纯化，对获得的抗氧化肽进行质谱分析。最后，考察鲍鱼蛋白肽对氧化损伤的人皮肤细胞和人肿瘤细胞增殖的影响。
　　首先，本文利用超滤膜对鲍鱼内脏酶解物进行分离，考察了各分子量段酶解物的成分组成和抗氧化活性。利用截留分子量为10000 Da、3000 Da、500 Da的超滤膜分离得到FA、FB、FC和FD四个组分中，FA组分的总糖和蛋白含量分别为34.06％和17.20％，而FB、FC和FD等组分主要是由蛋白组成，其游离氨基酸含量分别高达23.20 g/100 g，25.47 g/100g和28.68 g/100 g。根据Tricine-SDS-PAGE、液相色谱和β-消除反应的分析结果，表明FA组分含有N-糖苷键结合的糖蛋白和分子量25 kDa的蛋白，FB、FC和FD的分子量主要分布在300 Da左右。体外抗氧化结果表明，FD组分具有较好的清除自由基活性。
　　其次，在鲍鱼内脏蛋白肽小试放大试验中，利用截留分子量为10000 Da、1000 Da、200 Da膜分离得到FA、FB和FC三个组分。FA组分的总糖和蛋白含量分别为21.49％和55.12％，而FB和FC主要由蛋白肽构成。氨基酸组成分析结果显示，在FC组分中疏水性氨基酸(Leu、Phe和Tyr)含量最高。三个分离组分主要含有钾、钠、磷等矿物质。根据蛋白肽抑制亚油酸自动氧化的结果，发现FC组分具有最高的抗氧化能力。FC组分经凝胶柱和反向色谱分离后，获得分子量440.0154 Da酪氨酸肽和分子量522.1545 Da苯丙氨酸肽。
　　最后，考察了AVP对人皮肤细胞和人肿瘤细胞的影响。结果发现，鲍鱼内脏蛋白肽对HSF细胞的增殖效果明显优于HaCat细胞。在H2O2诱导的细胞氧化损伤模型中，经1.00-4.00 mg/mL的AVP预孵后能明显提高HSF细胞存活率、提高细胞外SOD、GS H-Px以及细胞内SOD活性、降低细胞MDA含量。经0.25-4.00 mg/mL的AVP预孵后虽然能明显提高HaCat细胞存活率，但只有1 mg/mL的AVP能明显提高HaCat细胞外GSH-Px活性以及胞内GSH-Px和SOD活性，并使胞内MDA含量出现一定程度的下降。另一方面，当培养液含浓度＞2.00 mg/mL的AVP时，MDA-MB-231细胞和HepG2细胞的生长都得到明显的抑制，而且MDA-MB-231细胞的存活率明显低于HepG2细胞。根据细胞形态学观察的结果，当肿瘤细胞生长受到抑制时，MDA-MB-231细胞会收缩变圆，而HepG2细胞结团数目减少、细胞体积变小，两种细胞都可以发现活细胞减少、凋亡细胞增加。不管是MDA-MB-231细胞还是HepG2细胞，在琼脂糖电泳中都没有发现DNA降解片段。
　　综上所述，酶解结合超滤制备的鲍鱼内脏蛋白肽具有较好的抗氧化活性，其酪氨酸肽和苯丙氨酸肽是主要的抗氧化成分。低浓度的蛋白肽能促进人HSF细胞和HaCat细胞的增殖，对H2O2诱导氧化损伤的皮肤细胞起到保护作用;高浓度的蛋白肽能抑制人MDA-MB-231和HepG2细胞的增殖。

目录

声明

摘要

第1章 引言

1．1 蛋白肽的研究与应用进展

1．1．1 蛋白肽的概述

1．1．2 蛋白肽的制备技术

1．1．3 蛋白肽的生理功能

1．2 抗氧化肽的应用

1．2．1 食品添加剂

1．2．2 功能保健食品和药品

1．2．3 化妆品

1．3 鲍鱼内脏的利用现状

1．4 研究目的与意义

1．5 研究内容

第2章 鲍鱼内脏蝴的制备及其体外抗氧化活性的研究

2．1 实验材料

2．1．1 实验原料

2．1．2 主要试剂与耗材

2．1．3 主要仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 鲍鱼内脏酶解物的制备

2．2．2 基本成分

2．2．3 氨基酸组成

2．2．4 Tricine-SDS-PAGE

2．2．5 HPLC

2．2．7 抗氧化活性的测定

2．2．8 数据统计与分析

2．3 结果与讨论

2．3．1 鲍鱼内脏及其酶解超滤物的成分

2．3．2 超滤组分的氨基酸组成

2．3．3 Tricine-SDS-PAGE

2．3．4 HPLC

2．3．5 β-消除反应

2．3．6 抗氧化活性

2．4 本章小结

第3章 鲍鱼内脏抗氧化肽的分离纯化及结构鉴定

3．1 实验材料

3．1．1 实验原料

3．1．2 主要试剂与耗材

3．1．3 主要仪器设备

3．2 实验方法

3．2．1 鲍鱼内脏酶解物小试制备

3．2．2 膜分离鲍鱼内脏酶解液

3．2．3 基本成分的测定

3．2．4 氨基酸组成的测定

3．2．5 矿物质含量的测定

3．2．6 亚油酸氧化抑制活性的测定

3．2．7 鲍鱼内脏抗氧化肽分离纯化及结构鉴定

3．2．8 数据统计与分析

3．3 结果与讨论

3．3．1 基本成分

3．3．2 氨基酸组成

3．3．3 矿物质组成

3．3．4 亚油酸自氧化抑制能力

3．3．5 抗氧化肽分离纯化及结构鉴定

3．4 本章小结

第4章 鲍鱼内脏蛋白肽对细胞的作用

4．1 实验材料

4．1．1 实验原料

4．1．2 主要试剂与耗材

4．1．3 主要仪器设备

4．1．4 试剂配制

4．2 实验方法

4．2．1 鲍鱼内脏酶解物小试制备

4．2．2 膜分离鲍鱼内脏酶解液

4．2．3 鲍鱼内脏蛋白肽对H2O2诱导人皮肤细胞损伤的作用

4．2．4 鲍鱼内脏蛋白肽对人肿瘤细胞的作用

4．2．5 数据统计与分析

4．3 结果与讨论

4．3．1 生长曲线绘制

4．3．2 鲍鱼内脏蛋白肽对人皮肤细胞的作用

4．3．3 鲍鱼内脏蛋白肽对人肿瘤细胞的作用

4．4 本章小结

5．1 结论

5．2 展望

论文的创新点

致谢

参考文献

在学期间发表的学术论文