乳及乳制品中阪崎肠杆菌PCR-DHPLC检测新技术的建立

摘要

坂崎杆菌是人和动物肠道内寄生的一种革兰氏阴性无芽孢杆菌，属肠道杆菌科的一种，是条件致病菌。阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症，并且可能引起神经系统后遗症和死亡，死亡率高达50％以是。阪崎肠杆菌传统检测方法要用前增菌和选择性增菌等多种培养基，培养、鉴定、操作步骤繁杂，工作量大，从培养到生化鉴定耗时至少5～8d。在食品安全面临严峻挑战的形势下，只有建立快速诊断、鉴定技术，才能正确选择抗菌药物，追踪病菌的来源。变性高效液相色谱(DHPLC)又称核苷酸片段分析系统，采用高压闭合液相流路，利用离子对反相液相色谱技术进行核酸片段的分离和分析，甚至可以对细微差异的DNA序列进行分析，从菌株水平快速识别病原菌。本文应用聚合酶链式反应(PCR)结合DHPLC技术建立了食品中阪崎肠杆菌的快速检测方法：根据阪崎肠杆菌16S-23S rRNA特异基因序列的特点，设计、合成特异性引物并进行引物筛选和PCR体系的优化，扩增产物经DHPLC技术进行核苷酸分析以达到快速检测坂崎肠杆菌的目的。首先以阪崎肠杆菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌等59株参考菌株做特异性试验、重现性试验;并将阪崎肠杆菌菌株稀释成不同梯度，做灵敏度试验;结果表明该方法具有较好的特异性，灵敏度较高，检测低限可达到为25CFU／mL。用该方法筛选检测670份检验样品，有7株阪崎肠杆菌分离菌株为阳性，与PCR法、实时荧光PCR法筛选检测的结果一致。用传统的培养鉴定方法检测这7株菌，结果均为阪崎肠杆菌阳性;验证试验表明：PCR-DHPLC方法准确度为100％，显示该方法具有较好的适用性。结论：该方法可以快速、准确检测阪崎肠杆菌，是食品中致病菌快速检测的新技术。