一种用于检测原料乳及乳制品中β-内酰胺酶的检测装置及其检测方法

摘要

本发明公开了一种用于检测原料乳及乳制品中β-内酰胺酶的检测装置及其检测方法，包括检测试纸条、标准比色卡；标准比色卡由9个色块组成，从浅到深分别对应于0U/mL、6U/mL、12U/mL、25U/mL、50U/mL、100U/mL、150U/mL、200U/mL、250U/mL的β-内酰胺酶浓度；检测试纸条由过滤层、显色层、吸水材料层和基板组成，以2,2'-联喹啉乙醇溶液作为显色剂和CuSO

说明书

技术领域

本发明属于食品安全检测技术领域，具体为一种用于检测原料乳和乳制品中β-内酰胺酶的检测装置及其检测方法。

背景技术

β-内酰胺酶（β-lactamase），俗称生鲜牛乳抗生素分解剂，又名解抗剂或金玉兰酶制剂，它是由革兰氏阳性细菌产生和分泌的，可选择性分解牛奶中残留的β-内酰胺类抗生素，使微生物法、酶联免疫法等常规的检测方法失效，从而无法正确判断是否为“无抗奶”，掩盖抗生素超标的事实。

β-内酰胺类抗生素是在牛奶生产中应用最广泛的抗生素，用于治疗牛乳房炎和其他细菌感染性疾病，如果不严格按照规定治疗牛乳炎等疾病，滥用抗生素，就会造成牛乳中的抗生素超标。由于抗生素的存在，一方面难以成为安全合格的产品，另一方面，还会影响酸奶、奶酪等奶制品的加工生产。Korycka-Dahl M.等（1985）利用β-内酰胺酶降解牛奶中残留的抗生素，可降低至常规检测方法无法检测的水平。一些不法分子将β-内酰胺酶用作牛奶中抗生素的分解剂，以掩盖其抗生素残留超标的事实，从而使抗生素超标奶变成合格奶，这就造成了外源性β-内酰胺酶的违法添加。

β-内酰胺酶能够使青霉素内酰胺结构破坏而失去活性，导致青霉素、头孢菌素等抗生素类药物耐药性增高，从而大大降低了人们抵抗传染病的能力，给消费者的身体健康带来危害。青霉素在β-内酰胺酶作用下，酶中亲核性基团向β-内酰胺环进攻，开环后可脱羧重排生成中间体青霉噻唑酸。以青霉素为代表的β-内酰胺类抗生素过敏反应非常普遍，引起过敏反应的基本物质有两种，一种是青霉素裂解生成一些青霉噻唑酸，与蛋白质结合形成抗原而致敏。另一种过敏源是一些高聚物，为β-内酰胺环开环后自身聚合而成，聚合程度越高，过敏反应越强。虽然由于添加β-内酰胺酶造成青霉素过敏的病例并未被研究证明，但根据青霉素的过敏机理，以及β-内酰胺酶的添加可能会造成β-内酰胺类抗生素耐药性的原因，确实应该对β-内酰胺酶的滥加提高警惕，严加管理。有些微生物虽然可以产生β-内酰胺酶，但由于采奶方式、牛奶的组分、消毒方法和包装储存方法等不适于产β-内酰胺酶微生物的生存，在非人为添加β-内酰胺酶的条件下是无法检测到微生物产生的β-内酰胺酶的。

2009年2月4日，根据卫生部等九部门《关于开展全国打击违法添加非食用物质和滥用食品添加剂专项整治的紧急通知》的规定，为配合全国打击违法添加非食用物质和滥用食品添加剂专项整治工作的深入开展，专项整治专家委员会提出《食品中可能违法添加的非食用物质名单》，其中就包括β-内酰胺酶。外源性β-内酰胺酶是我国不允许在食品中使用的化学物质，它的使用掩盖了牛奶中抗生素的残留的事实。

为了广大消费者的身体健康，维护乳制品市场良好的竞争环境，建立一种简单、方便、经济的乳制品中β-内酰胺酶的快速检测试纸已经是一个亟需解决的问题。

发明内容

为了克服上述现有技术中的不足，本发明的提供一种原料乳及乳制品中β-内酰胺酶检测试纸及其标准比色卡，并提供一种利用该试纸方便、快捷测定样品中β-内酰胺酶含量的方法。

一种用于检测原料乳及乳制品中β-内酰胺酶的装置，包括检测试纸和β-内酰胺酶标准比色卡；其中所述的检测试纸由过滤层(1)、显色层(2)、吸水材料层(3)和基板(4)组成，过滤层(1)、显色层(2)、吸水材料层(3)粘贴在基板(4)上，且同时依次连接；其中所述的β-内酰胺酶标准比色卡由9个色块(5)组成，从浅到深对应于β-内酰胺酶浓度梯度分别为0U/mL、6U/mL、12U/mL、25U/mL、50U/mL、100U/mL、150U/mL、200U/mL、250U/mL。

所述的检测试纸过滤层(1)用玻璃棉制成，显色层(2)由醋酸纤维素膜制成，吸水层(3)由中性滤纸制成，基板(4)由PVC薄片制成。

所述显色层(2)的制备包括步骤：配置0.5%～1.0 % 2,2'-联喹啉乙醇溶液和0.1~0.3mol/L CuSO₄溶液，混合均匀后，将醋酸纤维素膜浸入上述混合溶液5~10min后取出，放入真空干燥箱内40～80℃干燥20～50min后组装成检测试纸。

所述β-内酰胺酶标准比色卡的具体制备步骤如下：

(1)配制青霉素底物浓度为5000U/mL的溶液9份，分别加入浓度为0U/mL、6U/mL、12U/mL、25U/mL、50U/mL、100U/mL、150U/mL、200U/mL、250U/mL β-内酰胺酶标准溶液，混合均匀后37℃水浴60min；

(2)取出后加入5mL添加10%~15%TCA，4000rpm离心10min，取上清液100μL，然后取制备的检测试纸浸入上清液5~10min后取出，进行显色反应；

(3)根据测色仪测量试纸显色的色度值，利用颜色模块软件对色彩数据进行模拟，制作标准比色块；或者利用计算机Adobe Photoshop编辑不同颜色的RGB值，编辑出与标准β-内酰胺酶浓度相匹配的颜色，制备出标准色块；按β-内酰胺酶浓度标准显色排列、粘贴，制成β-内酰胺酶标准比色卡。

用于检测原料乳及乳制品中β-内酰胺酶的装置的测定方法为：取原料乳或乳制品按1:1比例添加10%~15%的TCA，倒入离心管中，混合均匀后放入离心机，4000rpm离心10min，取上清液。取β-内酰胺酶检测试纸，浸入待测样品溶液2~5min，取出后内与β-内酰胺酶标准比色卡对照，即得到β-内酰胺酶的浓度范围。

积极有益效果：本发明的原理基于β-内酰胺酶分解青霉素钾的分解产物是青霉噻唑酸，青霉噻唑酸具有还原性,可将Cu²⁺还原为Cu⁺，而亚铜试剂2,2’-联喹啉与Cu⁺偶联生成紫红色络合物，且颜色随着β-内酰胺酶浓度大小成正相关，该检测方法快捷、方便，且准确率高，有利于市场的普及。

附图说明

图1检测试纸条结构示意图；

图2 β-内酰胺酶标准比色卡的结构图；

图中为：过滤层1、显色层2、吸水材料层3、基板4、色块5。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的说明：

一种用于检测原料乳及乳制品中β-内酰胺酶的装置，包括检测试纸条和β-内酰胺酶标准比色卡；所述的检测试纸由过滤层(1)、显色层(2)、吸水材料层(3)和基板(4)组成，过滤层(1)、显色层(2)、吸水材料层(3)粘贴在基板(4)上，且同时依次连接，如图1所示；其中所述的β-内酰胺酶标准比色卡由9个色块(5)组成，从浅到深对应于β-内酰胺酶浓度梯度分别为0U/mL、6U/mL、12U/mL、25U/mL、50U/mL、100U/mL、150U/mL、200U/mL、250U/mL，如图2所示。

所述的检测试纸条的过滤层(1)用玻璃棉制成，显色层(2)由醋酸纤维素膜制成，吸水层(3)由中性滤纸制成，基板(4)由PVC薄片制成。

所述显色层(2)的制备包括步骤：配置0.5%～1.0 % 2,2'-联喹啉乙醇溶液和0.1~0.3mol/L CuSO₄溶液，混合均匀后，将醋酸纤维素膜浸入上述混合溶液5~10min后取出，放入真空干燥箱内40～80℃干燥20～50min后组装成检测试纸。

所述β-内酰胺酶标准比色卡的具体制备步骤如下：

(1)配制青霉素底物浓度为5000U/mL的溶液9份，分别加入浓度为0U/mL、6U/mL、12U/mL、25U/mL、50U/mL、100U/mL、150U/mL、200U/mL、250U/mL β-内酰胺酶标准溶液，混合均匀后37℃水浴60min；

(2)取出后加入5mL 10%~15%TCA，4000rpm离心5~10min，取上清液100μL，然后取制备的检测试纸浸入上清液5~10min后取出，进行显色反应；

(3)根据测色仪测量试纸显色的色度值，利用颜色模块软件对色彩数据进行模拟，制作标准比色块；或者利用计算机Adobe Photoshop编辑不同颜色的RGB值，编辑出与标准β-内酰胺酶浓度相匹配的颜色，制备出标准色块；按β-内酰胺酶浓度标准显色排列、粘贴，制成β-内酰胺酶标准比色卡。

用于检测原料乳及乳制品中β-内酰胺酶的装置的测定方法为：取原料乳或者乳制品按1:1比例添加10%~15%的TCA，倒入离心管中，混合均匀后放入离心机，4000rpm离心5~10min，取上清液。取β-内酰胺酶检测试纸条，浸入待测样品溶液2~5min，取出后内与β-内酰胺酶标准比色卡对照，即得到β-内酰胺酶的浓度范围。

实施例1：

1. 检测试纸的制备：

称取2,2'-联喹啉0.5g,溶解在100mL乙醇溶液中，配制成0.5%的2,2'-联喹啉乙醇水溶液，称取2.5g的无水CuSO₄，溶解在100mL的水溶液中，配制成0.1mol/L CuSO₄的硫酸铜溶液，混合均匀后即得显色液。将醋酸纤维素膜浸入显色液中浸泡10min，取出置于玻璃板上真空干燥箱中45℃干燥30min，制备出显色层。将过滤层、显色层和吸收材料层粘贴在基板上，裁剪成10cm×1.0cm,即得β-内酰胺酶检测试纸（见图1）。

2.标准比色卡的制备

(1)配制分别含有浓度梯度0U/mL、6U/mL、12U/mL、25U/mL、50U/mL、100U/mL、150U/mL、200U/mL、250U/mL β-内酰胺酶的标准品溶液，分别加入青霉素钾底物浓度为5000U/mL的溶液中；混合均匀后37℃温浴60min后，4000rpm离心5~10min，取上清液在试纸上进行显色反应；

(2)利用分光测色仪测定试纸L*、a*和b*值数据，输入计算机，利用颜色模块软件对色彩L*、a*和b*数据进行模拟，制作标准比色块。按β-内酰胺酶的标准品溶液的浓度的高低，将标准比色块进行排列、粘贴，制成β-内酰胺酶的标准比色卡（见图2）。

3. β-内酰胺酶含量的测定：

(1)待测样品的制备：用市售牛奶配制含有0U/mL、6U/mL、12U/mL、25U/mL、50U/mL、100U/mL、150U/mL、200U/mL、250U/mL β-内酰胺酶，青霉素钾底物浓度皆为5000U/mL的9个样品，分别标记为1、2、3、4、5、6、7、8、9号样品，37℃水浴60min，按1:1比例添加10%的TCA，倒入离心管中，混合均匀后放入离心机，4000rpm离心10min，取上清液，制备出不同浓度的待测样品。

(2)取β-内酰胺酶测定试纸，浸入待测样品溶液5min，取出与标准比色卡对照，即得到β-内酰胺酶的浓度范围。

实施例2：

1. β-内酰胺酶检测试纸的制备：

称取2,2'-联喹啉0.8g,溶解在100mL乙醇溶液中，配制成0.8%的2,2'-联喹啉乙醇水溶液。称取7.5g的无水CuSO4，溶解在100mL的乙醇溶液中，配制成0.3mol/L CuSO4的硫酸铜溶液，混合均匀后即得显色液。将醋酸纤维素膜浸入显色液中浸泡15min，取出置于玻璃板上真空干燥箱中50℃干燥20min，制备出显色层。将过滤层、显色层和吸收材料层粘贴在基板上，裁剪成12cm×1.2cm,即得β-内酰胺酶检测试纸（见图1）。

2. β-内酰胺酶标准比色卡的制备

(1)配制分别含有0U/mL、6U/mL、12U/mL、25U/mL、50U/mL、100U/mL、150U/mL、200U/mL、250U/mL β-内酰胺酶的标准品溶液，青霉素钾底物浓度为5000U/mL的溶液；混合均匀后放进水浴锅内37℃温浴60min；4000rpm离心5~10min，取上清液在试纸上进行显色反应。

(2)以标准浓度的β-内酰胺酶显色为基准，利用计算机Adobe Photoshop编辑不同颜色的RGB值，以RGB值编辑成各种颜色的色块，再与标准浓度的β-内酰胺酶在试纸显色的颜色对比，编辑出与标准β-内酰胺酶浓度相匹配的颜色，制备出标准色块，按β-内酰胺酶浓度标准显色排列、粘贴，制成β-内酰胺酶标准比色卡（见图2)。

3. β-内酰胺酶含量的测定：

(1)待测样品的制备：用市售牛奶配制含有0U/mL、6U/mL、15U/mL、30U/mL、60U/mL、120U/mL、180U/mL、210U/mL、250U/mLβ-内酰胺酶，青霉素钾底物浓度皆为5000U/mL的9个样品，分别标记为1、2、3、4、5、6、7、8、9号样品，37℃水浴1h，按1:1比例添加15%的TCA，倒入离心管中，混合均匀后放入离心机，4000rpm离心10min，取上清液，制备出不同浓度的待测样品。

(2)取β-内酰胺酶测定试纸，浸入待测样品溶液5min，取出后与标准比色卡对照，即得到β-内酰胺酶的浓度范围。

实施例3：与高效液相法、分光光度计法的对比

将试纸法与高效液相法、可见分光光度法在检测限、相关性、可操作性、检测时间、操作简易程度上进行比较，如表1所示：

表1 试纸法与分光光度法测试方法的对比表

检测方法高效液相色谱法可见分光光度法试纸法实际最低检出限（U/mL）446相关性R²0.93310.99360.8061标准偏差（空白）——0.01650.0187检测时间（min）﹥18010820操作简易程度复杂较复杂简单

本发明的原理为，β-内酰胺酶分解青霉素钾的分解产物是青霉噻唑酸，青霉噻唑酸具有还原性,可将Cu²⁺还原为Cu⁺，而亚铜试剂2,2’-联喹啉与Cu⁺偶联生成紫红色络合物，且颜色随着β-内酰胺酶浓度大小成正相关，该检测方法快捷、方便，且准确率高，有利于市场的普及。

以上实施例仅用于说明本发明的优选实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在所述领域普通技术人员所具备的知识范围内，本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替代和改进等，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围之内。