一种用于检测原料乳及乳制品中β-内酰胺酶的试剂盒及其检测方法

摘要

本发明公开了一种用于检测原料乳及乳制品中β-内酰胺酶的试剂盒及其检测方法，该检测β-内酰胺酶的试剂盒试剂包括β-内酰胺酶标准品、青霉素钾标准液品、蛋白质沉淀剂三氯乙酸（TCA）、显色剂2,2'-联喹啉乙醇溶液和络合剂CuSO4。该检测方法为首先设定检测仪器参数，在空白管、标准管和样品管分别加入蒸馏水、标准液和样品，同时加入蛋白质沉淀剂TCA，充分振荡混合后放入离心机，4000rpm离心10min，取上清液加入2,2'-联喹啉乙醇溶液充分摇匀，室温静置5min后，通过仪器进行比色测定，根据显色反应的指示β-内酰胺酶的含量。本发明中的试剂盒及其检测方法操作简便易行，检测成本低，检测结果准确，能够实现对原料乳及乳制品中β-内酰胺酶的快速检测。

说明书

技术领域  

本发明涉及用于检测和半定量测定原料乳及乳品中β-内酰胺酶的试剂盒及其制备方法，属于食品安全检测领域。

背景技术

β-内酰胺酶（β-lactamase），俗称生鲜牛乳抗生素分解剂，又名解抗剂或金玉兰酶制剂，它是由革兰氏阳性细菌产生和分泌的，可选择性分解牛奶中残留的β-内酰胺类抗生素，使微生物法、酶联免疫法等常规的检测方法失效，从而无法正确判断是否为“无抗奶”，掩盖抗生素超标的事实。

β-内酰胺类抗生素是在牛奶生产中应用最广泛的抗生素，用于治疗牛乳房炎和其他细菌感染性疾病，如果不严格按照规定治疗牛乳炎等疾病，滥用抗生素，就会造成牛乳中的抗生素超标。由于抗生素的存在，一方面难以成为安全合格的产品，另一方面，还会影响酸奶、奶酪等奶制品的加工生产。Korycka-Dahl M.等（1985）利用β-内酰胺酶降解牛奶中残留的抗生素，可降低至常规检测方法无法检测的水平。一些不法分子将β-内酰胺酶用作牛奶中抗生素的分解剂，以掩盖其抗生素残留超标的事实，从而使抗生素超标奶变成合格奶，这就造成了外源性β-内酰胺酶的违法添加。

β-内酰胺酶能够使青霉素内酰胺结构破坏而失去活性，导致青霉素、头孢菌素等抗生素类药物耐药性增高，从而大大降低了人们抵抗传染病的能力，给消费者的身体健康带来危害。青霉素在β-内酰胺酶作用下，酶中亲核性基团向β-内酰胺环进攻，开环后可脱羧重排生成中间体青霉噻唑酸。以青霉素为代表的β-内酰胺类抗生素过敏反应非常普遍，引起过敏反应的基本物质有两种，一种是青霉素裂解生成一些青霉噻唑酸，与蛋白质结合形成抗原而致敏。另一种过敏源是一些高聚物，为β-内酰胺环开环后自身聚合而成，聚合程度越高，过敏反应越强。虽然由于添加β-内酰胺酶造成青霉素过敏的病例并未被研究证明，但根据青霉素的过敏机理，以及β-内酰胺酶的添加可能会造成β-内酰胺类抗生素耐药性的原因，确实应该对β-内酰胺酶的滥加提高警惕，严加管理。有些微生物虽然可以产生β-内酰胺酶，但由于采奶方式、牛奶的组分、消毒方法和包装储存方法等不适于产β-内酰胺酶微生物的生存，在非人为添加β-内酰胺酶的条件下是无法检测到微生物产生的β-内酰胺酶的。

2009年2月4日，根据卫生部等九部门《关于开展全国打击违法添加非食用物质和滥用食品添加剂专项整治的紧急通知》的规定，为配合全国打击违法添加非食用物质和滥用食品添加剂专项整治工作的深入开展，专项整治专家委员会提出《食品中可能违法添加的非食用物质名单》，其中就包括β-内酰胺酶。外源性β-内酰胺酶是我国不允许在食品中使用的化学物质，它的使用掩盖了牛奶中抗生素的残留的事实。

为了广大消费者的身体健康，维护乳制品市场良好的竞争环境，建立一种简单、方便、经济的原料乳及乳制品中β-内酰胺酶的快速检测试剂盒及其检测方法，已经是一个亟需解决的问题。

发明内容

为了克服上述现有技术中的不足，本发明的提供一种检测灵敏度高、准确性好，操作简便、省时、结果稳定可靠、能广泛用于食品安全部门检测β-内酰胺酶的检测试剂盒及其检测方法。

本发明的目的是这样实现的：

一种用于检测原料乳及乳制品中β-内酰胺酶的试剂盒，包括β-内酰胺酶标准品、青霉素钾标准液品、蛋白质沉淀剂三氯乙酸（TCA）、显色剂2,2'-联喹啉乙醇溶液和络合剂CuSO₄；其中所述试剂β-内酰胺酶标准品酶活度为2000U/mL, 青霉素钾标准液品浓度为50000U/mL，蛋白质沉淀剂TCA 浓度为10%~15%，2,2'-联喹啉乙醇溶液浓度为0.05%~0.1%，络合剂CuSO₄浓度为20~40mmol/L。 

所述青霉素噻唑酸标准反应液是按照如下方法制备得到的：青霉素钾底物浓度50000U/mL，加入2000U/mL β-内酰胺酶，37℃水浴60min；高速冷冻离心（10000rpm）10min，上清液即为青霉素噻唑酸标准反应液。

   一种用于检测原料乳及乳制品中β-内酰胺酶的试剂盒，其用于检测乳制品中β-内酰胺酶的检测方法，具体步骤如下：

(1)依照反应原理和仪器性能设定检验参数；

(2)在空白管里加入蒸馏水，在标准管里加入标准液，在样品管里加入原料乳或乳制品；

(3)将步骤(2)中的空白管、标准管和样品管同时加入蛋白质沉淀剂10%~15%TCA，充分振荡5min，4000rpm离心10min，离心后取上清液100~200μL，加入2.5~3.5mL 2,2'-联喹啉乙醇，0.2~0.4mL 20mmol/mL CuSO₄溶液，充分摇匀，室温静置5 min的显色反应后，利用可见分光光度计测定吸光度值，计算实验结果。

  所述的吸光度法采用单波长检测，在547nm单波长条件下测定吸光度。

积极有益效果：发明的原理，β-内酰胺酶分解青霉素钾的分解产物是青霉噻唑酸，青霉噻唑酸具有还原性,可将Cu²⁺还原为Cu⁺，而亚铜试剂2,2’-联喹啉与Cu⁺偶联生成紫红色络合物，利用可见分光光度计测定络合物，在547nm处有最大吸收峰，且颜色随着β-内酰胺酶浓度大小成正相关（见图1）。

附图说明

图1反应原理图；

图2 青霉素钾标准品液相色谱图；

图3青霉素噻唑酸的液相色谱图；

图4 吸光度与β-内酰胺酶的线性关系图。

具体实施方式

一种用于检测原料乳及乳制品中β-内酰胺酶的试剂盒，包括β-内酰胺酶标准品、青霉素钾标准液品、蛋白质沉淀剂三氯乙酸（TCA）、显色剂2,2'-联喹啉乙醇溶液和络合剂CuSO₄；其中所述试剂β-内酰胺酶标准品酶活度为2000U/mL, 青霉素钾标准液品浓度为50000U/mL，蛋白质沉淀剂TCA 浓度为10%~15%，2,2'-联喹啉乙醇溶液浓度为0.05%~0.1%，络合剂CuSO4浓度为20~40mmol/L。 

下面结合附图和具体实施例，对本发明作进一步的说明：

一种用于检测原料乳及乳制品中β-内酰胺酶的试剂盒，其特征在于包括β-内酰胺酶标准品、青霉素钾标准液品、蛋白质沉淀剂三氯乙酸（TCA）、显色剂2,2'-联喹啉乙醇溶液和络合剂CuSO₄；其中所述试剂β-内酰胺酶标准品酶活度为2000U/mL, 青霉素钾标准液品浓度为50000U/mL，蛋白质沉淀剂TCA 浓度为10%~15%，2,2'-联喹啉乙醇溶液浓度为0.05%~0.1%，络合剂CuSO₄浓度为20~40mmol/L。 

所述青霉素噻唑酸标准反应液是按照如下方法制备得到的：

青霉素钾底物浓度为50000U/mL，加入2000U/mL β-内酰胺酶，37℃水浴60min；高速冷冻离心（10000rpm）10min，上清液即为青霉素噻唑酸标准溶液。青霉素钾的标准品的和青霉素噻唑酸高效液相图谱如图2和3所示。

   一种用于检测原料乳及乳制品中β-内酰胺酶的试剂盒，其用于检测乳制品中β-内酰胺酶的检测方法，具体步骤如下：

(1)依照反应原理和仪器性能设定检验参数；

(2)在空白管里加入蒸馏水，在标准管里加入标准液，在样品管里加入原料乳或乳制品；

(3)将步骤(2)中的空白管、标准管和样品管同时加入蛋白质沉淀剂10%~15%TCA，充分振荡5min，4000rpm离心10min，离心后取上清液100~200μL，加入2.5~3.5mL 2,2'-联喹啉乙醇，0.2~0.4mL 20mmol/mL CuSO₄溶液，充分摇匀，室温静置5 min的显色反应后，利用可见分光光度计测定吸光度值，计算实验结果。

   所述的检吸光度法采用单波长检测，在547nm单波长条件下测定吸光度。

实施例1

本发明提供一种检测原料乳及乳制品中β-内酰胺酶的试剂盒，包括β-内酰胺酶标准品、青霉素钾标准液品、显色剂0.05% 2,2'-联喹啉乙醇溶液、蛋白沉淀剂10%TCA和20mmol/L CuSO₄。

(1)青霉素噻唑酸标准反应液是按照如下方法制备得到的：

青霉素钾底物浓度为50000U/mL，加入2000U/mL β-内酰胺酶，37℃水浴60min；高速冷冻离心（10000rpm）10min，上清液即为青霉素噻唑酸标准溶液。

(2)试剂盒试剂的配置

10%TCA的配置：10g三氯乙酸溶于100mL水中；

0.05% 2,2'-联喹啉乙醇溶液: 0.05g 2,2'-联喹啉溶于100mL乙醇中；

20mmol/L CuSO₄：0.5g无水CuSO₄溶于100mL蒸馏水。

实施例2

一种检测原料乳及乳制品中β-内酰胺酶的试剂盒，在进行β-内酰胺酶检测时，该方法的具体步骤如下：

(1)分别取0μL、40μL、120μL、250μL、500μL、1000μL、1500μL、2000μL的青霉素噻唑酸标准反应液，定容至10mL，配制成青霉素噻唑酸标准使用液。

(2)设置仪器检测参数，检测波长547nm;

    (3)取蒸馏水、乳制品和青霉素噻唑酸标准反应液体5mL，分别加入蛋白沉淀剂15%TCA 5mL，倒入离心管中4000rpm离心10min;

(4)取上清液100μL，置入试管，加入0.1% 2,2'-联喹啉乙醇溶液2.5mL和40mmol/L CuSO4 0.1mL混合均匀，室温经5min的显色反应后，利用可见分光光度计测定吸光度值，计算实验结果。

实施例3 

试剂盒最低检出限的测试

(1)用牛奶配制分别含有0U/mL、4U/mL、12U/mL、25U/mL、50U/mL、100U/mL、150U/mL、200U/mL、250U/mL β-内酰胺酶的样品，青霉素钾底物浓度为5000U/mL的溶液,混合均匀后37℃水浴60min；

(2)取出后按1:1比例添加15%的TCA溶液5 mL，充分振荡后放入离心机，4000rpm离心10min, 加入0.05% 2,2'-联喹啉乙醇溶液3.5mL和30mmol/L CuSO4 0.2mL混合均匀，室温经5min的显色反应；

(3)利用可见分光光度计在547nm测定吸光度，计算实验结果。

(4)绘制标准曲线：以不同浓度的β-内酰胺酶（U/ mL）标准品溶液作为纵X标，以吸光度值作为Y值，绘制标准曲线（如图4所示）。其中空白管的测试结果如表1所示，其理论检出限为3.44U/mL，实际检出限为4 U/mL。

 

表1 空白试验重复试验547nm处的吸光度

由表1可计算该法的理论检出限为：

     CL=3S_b/b=3×0.058/0.0144=3.44U/mL

实施例4 

试剂盒测试方法与其他方法的对比

　  将碘量法、高效液相色谱法、可见分光光度法和试剂盒在检测限、相关性、可操作性、检测时间、操作简易程度上进行比较，如下表2所示。

表2 试剂盒测试方法与其他方法的对比

检测方法碘量法酸度法高效液相色谱法可见分光光度法试剂盒实际最低检出限（U/mL）1512.3444相关性R²0.98950.99170.93310.99360.9882标准偏差（空白）1.370.066——0.01650.0165检测时间（min）120120﹥18010875操作简易程度一般一般复杂较复杂简单

积极有益效果：发明的原理，β-内酰胺酶分解青霉素钾的分解产物是青霉噻唑酸，青霉噻唑酸具有还原性,可将Cu²⁺还原为Cu⁺，而亚铜试剂2,2’-联喹啉与Cu⁺偶联生成紫红色络合物，利用可见分光光度计测定络合物，在547nm处有最大吸收峰，且颜色随着β-内酰胺酶浓度大小成正相关。本发明中的试剂盒及其检测方法操作简便易行，检测成本低，检测结果准确，能够实现对原料乳及乳制品中β-内酰胺酶的快速检测。

以上实施例仅用于说明本发明的优选实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在所述领域普通技术人员所具备的知识范围内，本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替代和改进等，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围之内。