一种治疗炎症性皮肤病的青蒿富倍半萜提取物外用制剂的制备及应用

摘要

本发明属于生物医学领域，为一种青蒿富倍半萜提取物外用制剂的制备及其在防治湿疹、痤疮等炎症性皮肤病中的应用。原料药中可定量的青蒿素、青蒿丙素、二氢青蒿酸、青蒿素I及青蒿酸5种倍半萜成分含量大于50％，可定量的紫花牡荆素及艾黄素2种黄酮类成分含量约为1.5％。将所述原料药加上药学上可接受的辅料，制备得到用于治疗湿疹、痤疮的等炎症性皮肤病的外用制剂。该外用制剂具有调节皮肤炎症、缓解水肿的功效，对炎症性皮肤病引起的红斑、瘙痒、肿胀、皮肤紧致等症状有良好的缓解乃至消除的效果。相较口服化学药、生物制剂等治疗方式，患者对于外用该抗炎制剂具有更好的顺应性。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体为青蒿富倍半萜提取物外用制剂的制备及其在治疗与预防湿疹、痤疮等炎症性皮肤病中的应用。

背景技术

炎症性皮肤病是一类以皮肤炎症反应为主要表现的皮肤病，包括特应性皮炎(湿疹)、银屑病、接触性皮炎、玫瑰痤疮等。这些皮肤病的发生与遗传、免疫、环境等多种因素有关，且具有慢性、复发、难治的特点，给患者的生活质量带来严重影响。根据《全球疾病负担研究报告》，2019年全球约有10亿人患有某种形式的炎性皮肤病，其中特应性皮炎是最常见的一种，其患者人数约为2.6亿。因此，探索炎性皮肤病的防治方法具有重要的公共卫生和临床意义。

近年来，除了传统的抗组胺药、抗生素、局部皮质类固醇和免疫调节剂等炎性皮肤病治疗方案外，还出现了一些新药物和新方法，如针对特定细胞因子或信号通路的生物制剂和JAK抑制剂等。整体上评价，当前的药物治疗方案存在较为严重的不良反应，从而限制其长期使用。例如：长期或过度使用局部类固醇(如糠酸类固醇)可能导致皮肤萎缩、毛细血管扩张、色素沉着、皮肤干燥、皮肤薄弱、感染等不良反应；抗组胺药(如西替利嗪)可能引起口干、头晕、恶心、疲劳等不良反应；免疫抑制剂(如环孢菌素、甲氨蝶呤)可能导致免疫功能抑制，增加感染的风险等。因此，探寻更为有效且安全的炎性皮肤病防治方案具有一定的现实意义。

在《神农本草经》中，青蒿被记载有“主疥瘙痂痒恶疮”的功效，发明人认为该类功效应与治疗皮肤炎症有关。青蒿及其有效成分已经在抗疟疾领域取得了显著的治疗效果，但在炎症性皮肤病防治方面的应用并不充分。因此本发明人提供了一种应用中药青蒿富倍半萜提取物预防和治疗炎症性皮肤病的方案，以期解决当前疗效仍不太理想且长期使用不良反应较大等问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种青蒿富倍半萜提取物治疗湿疹、痤疮等炎症性皮肤病的外用制剂的制备方法和应用。

本发明提供的一种以青蒿富倍半萜提取物为原料药的外用制剂，其原料药中可定量的倍半萜成分含量大于50％，其中青蒿素(C

本发明得到一种青蒿富倍半萜提取物，提供了该提取物制备成软膏的方法，并提出制备含此提取物的外用制剂还可以同以下辅料制成相应的剂型：

1.软膏，基础剂：例如凡士林、白软膏、液体石蜡等；乳化剂：用于稳定水和油相的乳化软膏，例如棕榈酸聚甘油酯；防腐剂：例如苯酚、对羟基苯甲酸酯等，用于保持软膏的稳定性；抗氧化剂：例如生育酚(维生素E)等，用于延长软膏的保质期。

2.凝胶，凝胶基质：例如聚丙烯酸钠、羟丙基甲基纤维素等；溶剂：例如水、酒精、丙二醇等，用于溶解活性成分和形成凝胶；渗透增强剂：例如丁醇、二甘醇等，有助于提高药物在皮肤上的渗透性；稳定剂：例如甲基羟苯甲酸、聚山梨酸酯等，用于增加凝胶的稳定性。

3.乳膏，水基剂：例如水、甘油等；稳定剂：例如聚山梨酸酯、黄原胶等，用于保持乳膏的稳定性和均匀悬浮活性成分。乳化剂：例如辛酸/癸酸甘油酯、蜂蜡醇等，用于稳定水和油相的乳膏。抗氧化剂：例如生育酚(维生素E)等，用于延长乳膏的保质期。液体：溶剂：例如水、酒精、丙二醇等，用于溶解活性成分并形成液体制剂。防腐剂：例如苯酚、对羟基苯甲酸酯等，用于保持液体制剂的稳定性。表面活性剂：例如十二烷基硫酸钠、辛酸醇聚氧乙烯醚等，用于增强药物在皮肤上的吸收和分散性。

4.贴剂，胶基质：例如聚丙烯酸酯、丙烯酸酯等，用于形成胶状基质。促透剂：例如辛酸醇、辛酸/癸酸甘油酯等，有助于促进药物通过皮肤屏障。粘合剂：例如聚酯树脂、丙烯酸酯等，用于将贴剂粘附在皮肤上。

5.泡腾片，泡腾剂：例如碳酸氢钠、柠檬酸等，用于在水中产生泡沫。增稳剂：例如聚乙烯吡咯烷酮、聚山梨酸酯等，用于保持泡腾片的稳定性。清洁剂：例如表面活性剂，用于清洁皮肤和促进药物的吸收。

在制备上述外用制剂时，青蒿富倍半萜提取物为原料药。青蒿富倍半萜提取物及其为原料药的上述外用制剂，至少具备下述一种功效：

(1)预防湿疹、痤疮等炎症性相关皮肤疾病

(2)治疗湿疹、痤疮等炎症性相关皮肤疾病

(3)祛痘及祛斑美白作用

本发明的有益效果：

1.该青蒿提取物为倍半萜化合物富集部位，其中可定量的倍半萜成分含量大于50％，研究表明倍半萜类成分可通过改变角质层的屏障功能、增加皮肤血流量等方式促进药物透皮吸收，该提取物作为炎症性皮肤病外用制剂的原料药，有利于发挥药效。

2.该提取物已经过中试生产验证其质量具有均一稳定性。

3.该提取物已经过体内外抗炎活性评估，发现其具有良好的体内外广泛性抗炎活性。

4.在小鼠湿疹模型上评估了青蒿富倍半萜提取物的干预作用，发现其能显著缓解湿疹症状。

5.青蒿富倍半萜提取物在体外对痤疮丙酸杆菌具有明显的抑制作用。

附图说明

图1：原料药特征图谱叠加

图2：原料药对照特征图谱

图3：己烷的NIST数据库比对结果

图4：乙酸乙酯的NIST数据库比对结果

图5：对照品与供试品GC-MS总离子流程图

图6：原料药UPLC色谱图

图7：2种黄酮类成分对照品HPLC色谱图

图8：供试品HPLC色谱图

图9：青蒿富倍半萜提取物体外抗炎活性评估

图10：实施例中青蒿软膏对过敏性皮炎模型小鼠耳片的影响形态图

图11：实施例中青蒿软膏对过敏性皮炎模型小鼠耳片组织HE染色图

上述附图中，各数字分别代表以下化合物：

图2：4(S)、5、6、7、8分别为青蒿素、青蒿丙素、青蒿素I、二氢青蒿酸和青蒿酸图6：1：青蒿素；2：青蒿丙素；3：青蒿素I；4：二氢青蒿酸；5：青蒿酸

具体实施方式

本发明得到一种青蒿富倍半萜提取物外用制剂，提供了外用制剂中软膏的制备方法及其在治疗炎症性皮肤病方面的应用。下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。

实施示例1：青蒿富倍半萜提取物的中试生产及质量控制研究

(1)青蒿富倍半萜提取物的中试生产

称取青蒿75kg，加入10倍体积的石油醚(60℃～90℃)回流提取4次，每次1h，合并滤液，浓缩至一定程度后，缓缓通过60kg石油醚溶胀后的硅胶柱，以20％乙酸乙酯石油醚溶液进行洗脱。期间可多次取样，200mL洗脱液浓缩至10mL，至薄层检测不显示青蒿素斑点则视为洗脱完全，合并洗脱液，浓缩至一定程度后，置真空干燥箱中，40℃减压干燥至恒重，即得。

按照已经确定的中试生产条件，成功得到3批产品，分别为5140g、5261g以及5389g。3批产品的检测结果如表1所示。根据结果，3次生产均能使目标成分的转移率达到90％以上，且可定量成分含量占总成分的50％以上，产品均一性与稳定性良好，说明本工艺具有可操作性以及稳定性。

表1三批中试样品检测结果

(2)青蒿富倍半萜提取物的质量研究

对青蒿富倍半萜提取物进行包括溶解性、干燥失重以及溶剂残留的检查，并建立特征图谱，对其中的主要成分进行定量分析，深入表征其作为原料药的化学质量特征。

①实验方法

1)溶解性试验

精密称取青蒿富倍半萜提取物于相应容器中，加入定量的溶剂中，每隔5min强力振摇30s，观察30min内的溶解情况，如无目视可见的溶质颗粒，即视为完全溶解。分别对乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、乙腈、药用大豆油以及水进行了考察。

2)特征图谱的建立

分别取3批中试及3批小试青蒿富倍半萜提取物样品，制备原料药的供试品溶液，精密量取1μL注入液相色谱仪进行检测，所得色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行分析，以青蒿素峰为参照峰，计算峰青蒿丙素、青蒿素I、二氢青蒿酸和青蒿酸4种成分色谱峰的平均相对保留时间，并与原药材中所得到的结果进行对比。

3)干燥失重检查

分别取3批青蒿富倍半萜提取物，精密称定，平铺于干燥至恒重的称量皿中，使厚度在5mm以内，取下瓶盖并置于干燥器(干燥剂为硅胶)中，减压干燥，至重量不再有明显变化时，记录减失重量并计算干燥失重。

4)顶空进样GC-MS检测溶剂残留

对照品溶液的制备方法：用移液器分别精密吸取100μL石油醚和乙酸乙酯于10mL容量瓶中，分别精密称定取得的质量，加DMF定容至刻度，摇匀，再从中取200μL溶液于另一10mL容量瓶中用DMF定容即得。

供试品溶液的制备方法：取原料药样品1.5mg左右，精密称定，加入2mg无水氯化钙作为干燥剂，加4mL DMF超声至溶解，待冷却至室温后用DMF补足失重，9500r/min离心10分钟取上清液3mL于10mL顶空瓶中加盖密封即得。

色谱条件：进样口温度：170℃，分流比3:1，载气为氦气，总流量9mL/min，进样量2μL，柱温为程序升温，50℃保持6min，以20℃/min的速率升至100℃，保持5min，再以50℃/min的速率升至220℃，保持8min。检测器为质谱检测器，质谱条件：离子源为EI源，离子源温度250℃，离子能量70eV，采用SIM模式，扫描范围20～90m/z。自动顶空系统炉温80℃，平衡时间30min，进样传输线温度95℃，传输线温度100℃。

按上述对照品制备方法制备混合标准品溶液，按上述色谱条件进行检测，通过与NIST质谱库的比对确定乙酸乙酯与己烷(石油醚为混合物，成分以己烷为主，对该成分的定量来代替对石油醚的定量)的色谱峰，按二倍稀释法对对照品母液进行稀释，按上述色谱条件检测，以峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标做标准曲线。按上述供试品溶液制备方法制备3批样品的供试品溶液，按色谱条件进样检测，目标成分峰面积代入回归曲线计算含量。

5)倍半萜类成分含量测定及相对校正因子的计算

制备供试品溶液，精密量取1μL注入液相色谱仪进行检测，各目标成分峰面积代入标准曲线计算含量。

应用校正因子的方法定量除青蒿素外四种成分，并与标准曲线法进行对比，校正因子的公式如下。

相对校正因子＝(对照峰面积×目标峰浓度)/(目标峰面积×对照峰浓度)

6)黄酮类成分含量测定

供试品溶液的制备方法：取青蒿富倍半萜提取物约10mg，精密称定，精密加入4mL甲醇超声至溶解，过0.22μm微孔滤膜，即得。

系列标准溶液的制备方法：取紫花牡荆素和艾黄素对照品，精密称定，用甲醇溶解配制成浓度分别为3.84mg/mL和1.28mg/mL的标准储备液，用甲醇稀释得到浓度为1920μg/mL、1440μg/mL、960μg/mL、480μg/mL、240μg/mL和120μg/mL的紫花牡荆素系列标准母液以及浓度为640μg/mL、480μg/mL、320μg/mL、160μg/mL、80μg/mL和40μg/mL的艾黄素系列标准母液。

色谱条件：色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱条件如表2所示，进样量为10μL，检测波长为360nm。

表2HPLC定量2种黄酮类成分梯度洗脱条件

②实验结果

1)溶解性试验

对7种溶剂的溶解性试验结果如表3所示。其中青蒿富倍半萜提取物在乙醚、乙酸乙酯以及二氯甲烷中为易溶，在药用大豆油中为可溶，在甲醇、乙腈中为微溶，在水中为几乎不溶或不溶。

表3青蒿富倍半萜提取物的溶解性试验结果

2)特征图谱的建立

青蒿原药材与青蒿富倍半萜提取物原料药中4种主要成分平均相对保留时间对比结果如表4所示。青蒿富倍半萜提取物的色谱叠加图如图1所示，对照特征图谱如图2所示。定位了9个共有峰，其中峰4(S)、5、6、7、8分别为青蒿素、青蒿丙素、青蒿素I、二氢青蒿酸和青蒿酸的色谱峰。以青蒿素色谱峰为参照，其余4种成分的平均相对保留时间与原药材质量标准研究所得结果一致。

表4青蒿原药材与青蒿富倍半萜提取物中4种主要成分平均相对保留时间对比

3)青蒿富倍半萜提取物的干燥失重检查

3批样品的干燥失重结果如表5所示，减失总量均在5％以内。

表5中试三批样品干燥失重试验结果

4)顶空进样GC-MS检测溶剂残留

经过对比NIST质谱数据库，如图3、4所示，确定了己烷以及乙酸乙酯的色谱峰，对照品溶液以及供试品溶液的GC-MS总离子流程图如图5所示，其中己烷的保留时间为5.82min，乙酸乙酯的保留时间为7.23min。标准曲线的回归方程、相关系数以及线性范围如表6所示。3批产品的溶剂残留检测结果如表7所示。结果显示，3批中试样品的溶剂残留均可保持在不高于0.5％以内。

表6各溶剂回归方程、相关系数及线性范围

表7中试3批样品溶剂残留量检测结果(n＝3)

5)含量测定及相对校正因子的计算

青蒿富倍半萜提取物UPLC色谱图如图6所示。3批中试样品中各目标成分的定量检测结果如表8所示，除青蒿素外其余成分与青蒿素间的相对校正因子如表9所示，分别应用标准曲线法以及相对校正因子法计算其余4种倍半萜的结果对比如表10所示，根据结果，使用相对校正因子法计算所得的结果与标准曲线法所得结果相近，能够替代标准曲线法作为常规定量方法，可节省对照品的用量。

表8 3批中试样品各目标成分的定量检测结果

表9不同成分的相对校正因子

表10标准曲线法与校正因子法定量结果对比

6)黄酮类成分含量测定

HPLC检测混合对照品溶液及供试品溶液色谱图如图7和8所示，回归曲线、线性范围及相关系数如表11所示，3批中试样品中2种黄酮含量检测结果如表12所示。

表11 2种黄酮类成分回归曲线、线性范围及相关系数

表12天然ACTs原料药中2种黄酮类成分的含量检测结果

③讨论与结论

对3批中试样品以及3批小试样品的UPLC色谱图比对分析并定位到9个共有峰，其中峰4～8分别为青蒿素、青蒿丙素、青蒿素I、二氢青蒿酸和青蒿酸的色谱峰，以青蒿素峰为参照峰计算得到的相对保留时间与原药材中所得一致。经检测，生产过程中使用的有机溶剂乙酸乙酯和石油醚的残留量均在0.5％以内。由于石油醚是一种混合物，其中主要成分为己烷，因此对石油醚的定量以己烷计。在含量检测部分，相对于青蒿素，另外4种倍半萜成分的对照品获得较为困难，因此为了便于实际生产及检测的过程中节省对照品的用量或应对对照品短缺的情况，考察了相对校正因子计算其余4种倍半萜成分含量的准确度，结果表明该方法能够代替标准曲线法作为常规定量的方法。最终检测结果显示，青蒿富倍半萜提取物中约含青蒿素28.10％，青蒿丙素13.60％，二氢青蒿酸6.63％，青蒿酸1.63％和青蒿素I3.67％，5种倍半萜成分的总含量约为53.63％。HPLC定量2种黄酮类成分结果显示原料药中约含紫花牡荆素1.15％，艾黄素0.36％。

综上所述，经过对青蒿富倍半萜提取物的溶解度考察、特征图谱的建立、干燥失重检查、溶剂残留检查以及含量检测，结果显示，应用本工艺可稳定获得青蒿素含量不低于25％，5种倍半萜总含量不低于50％的青蒿富倍半萜提取物；该原料药各项检测均符合《中国药典》2020年版关于原料药的相关规定。

实施示例2：青蒿富倍半萜提取物体内外非特异性抗炎活性实验研究

(1)体内抗炎活性研究—角叉菜胶诱导的小鼠足肿胀

体重18～22g的ICR雄性小鼠40只，随机分为5组，每组8只。分别为：模型组、青蒿富倍半萜提取物(ACTs)低剂量组(100mg/kg)，ACTs中剂量组(200mg/kg)、ACTs高剂量组(400mg/kg)、DEX组(1mg/kg)。对应组灌胃给药1h后，所有组小鼠右后足跖注射1％角叉菜胶50μL致炎。4h后麻醉脱颈椎处死小鼠，从踝关节处对称剪下鼠足，称重，以左、右足重量差作为鼠足肿胀度。

统计学分析结果显示，ACTs具有抑制角叉菜胶诱导的小鼠足肿胀作用，且呈剂量依赖性特征，高剂量(400mg/kg)抑制率接近50％(如表1所示)。初步得出结论，ACTs可能具有良好的的体内抗炎活性。

表1各组角叉菜胶致小鼠足肿胀度比较(x±s)

与模型对照组相比较，**P<0.01。

(2)体外抗炎活性实验研究—LPS诱导原代小鼠腹腔巨噬细胞NO生成

采用LPS诱导小鼠腹腔原代巨噬细胞建立体外炎症模型，评估青蒿富倍半萜提取物对炎症因子NO生成的影响，并测定化合物的细胞毒性。

①腹腔巨噬细胞的制备：

C57BL/6J小鼠清洁级，雄性，体重18-22g。动物分笼饲养，适应观察7天。鼠腹腔注射3％巯基乙酸培养基，1.5ml/只，诱导巨噬细胞聚集；于诱导第4天(禁食12小时)后，小鼠眶静脉放血，处死，置75％乙醇浸泡3-5min；于生物安全柜内，小鼠腹部皮肤做V型切口，剥离皮肤；向腹腔内注入无菌PBS 8ml，轻揉小鼠腹部；抽出腹腔液体，置无菌离心管中，1500rpm离心5min；弃上清液，加入含5％ FBS的1640培养基10ml重悬细胞，1500rpm离心5min；弃上清液，加入含5％ FBS的1640培养基重悬细胞；台酚兰染色计细胞活率(＞80％)，计数，调整细胞浓度至1×10

②细胞增殖活性的测定：

孔板弃余下培养上清，每孔加入含MTT培养液(0.5mg/mL)各150μl，于37℃5％ CO

③Griess法测定上清NO含量：

1)Griess试剂的配制：0.1％ NED溶液与1％磺胺溶液1:1混合。

0.1％ NED溶液：取N-1-萘乙二胺盐酸盐0.1g，用蒸馏水溶解，定容至100mL，混匀。

1％磺胺溶液：取磺胺1.0g，用5％磷酸溶液溶解，定容至100mL，混匀。4℃避光保存。

2)标准曲线的制备：

亚硝酸盐标准品(0.12mol/L亚硝酸钠水溶液)：取亚硝酸钠0.828g，用蒸馏水溶解，定溶至100mL，混匀，4℃避光保存。用培养液对亚硝酸钠标准品溶液以1:250配制成稀释液，再进行倍比稀释。

3)样品测定：

取100ul细胞上清液及稀释好的标准品液于新96孔板中，后加入0.1％ NED溶液与1％磺胺溶液1:1混合液，25℃室温避光孵育10min。于酶标仪570nm处测定吸收值(OD)，根据标准曲线计算样品中NO含量。

(3)研究结果

实验结果发现，青蒿富倍半萜提取物体外抗炎活性良好，在LPS诱导原代腹腔巨噬细胞生成NO模型上能够显著抑制LPS诱导的NO浓度升高(详见图9)。其IC50约为59.40μg/mL，95％ CIIC50位54.41至64.73μg/mL。

实施示例3：青蒿富倍半萜提取物体外对痤疮丙酸杆菌的抑制作用研究

痤疮丙酸杆菌是一种正常共生于皮肤上的厌氧菌，当毛囊皮脂腺导管堵塞时，会大量繁殖并引起炎症，导致痤疮的发生。肉汤稀释法是一种测定最小抑菌浓度(MIC)的方法。

方法与结果

琼脂平板稀释法：

将不同浓度的青蒿富倍半萜提取物和克林霉素溶液(500、250、125、62.5、31.25、15.625mg/mL)分别加入含有0.5％葡萄糖的琼脂培养基中，制成含药琼脂平板。

将痤疮丙酸杆菌悬液(10

将琼脂平板倒置于37℃厌氧箱中培养24小时，观察并记录各含药平板上的菌落数。

最小抑菌浓度(MIC)的判定：将平板置于暗色、无反光物体表面，观察能够完全抑制细菌生长的最低药液浓度，为对细菌的最低抑菌浓度(MIC)。结果见表13，青蒿富倍半萜提取物对痤疮丙酸杆菌的最低抑制浓度为125μg/mL。

表13青蒿富倍半萜提取物对痤疮丙酸杆菌的抑制作用

实施示例4：青蒿富倍半萜提取物O/W型软膏的制备

按处方称取提取物、白凡士林、硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、液体石蜡和羊毛脂，加热至75℃，即得油相。称取三乙醇胺、甘油、羟苯乙酯溶液和蒸馏水加热至75℃，即得水相。将水相缓慢加入油相内，边加入边沿同一方向搅拌，使其发生乳化，不断搅拌10分钟，至混合物完全冷却，即得O/W型基质青蒿富倍半萜提取物软膏。

按上法分别制备低、中、高3个剂量的青蒿软膏，分别相当于生药量0.4g/g，0.8g/g，1.6g/g。制备好的青蒿软膏呈淡黄绿色，细腻均匀，无分层现象，且易于涂布。

实施示例5：青蒿富倍半萜提取物软膏治疗湿疹等炎症性皮肤病的实验研究

(1)动物分组与给药

70只KM小鼠饲养于SPF级别动物饲养室中，适应性喂养1周后，将小鼠随机分成对照组、模型组、阳性对照组、青蒿软膏低剂量组、青蒿软膏中剂量组、青蒿软膏高剂量组和阴性对照组，每组小鼠10只，雌雄各半。实验前1天，除对照组和阴性对照组外，其余各组小鼠腹部去除面积约2cm

给药方法：除模型组外，其余6组小鼠右耳廓内侧分别涂抹空白基质软膏、醋酸地塞米松软膏、青蒿低、中、高剂量软膏(分别相当于生药量0.4g/g、0.8g/g和1.6g/g)及高剂量青蒿软膏，涂抹剂量为2.5g/kg/次，每天2次，连续给药12天后，使用蒸馏水洗去药物并擦净，随后检测下列各项指标。

(2)指标检测

①小鼠耳变应反应评分

小鼠饲养过程中，观察给药前后，青蒿软膏对小鼠的毛色、饮食、活动等一般状况的影响，根据小鼠耳变应反应评分标准对小鼠耳变应反应症状进行评分(见表14)，以红斑、水肿、抓痕评分总和为综合评分。

表14小鼠耳变应反应评分标准

②耳厚度差

小鼠在实验前一天先使用游标卡尺测量右耳中部厚度，记录为day0，随后在每次激发24h后再测量1次，并分别记录为day7、day11、day15、day19，通过记录激发前后的右耳厚度，计算差值，以观察青蒿软膏对小鼠耳部炎症的改善情况。

③耳重量差

脱颈处死小鼠，随后将双耳剪下，用6mm打孔器在双耳中部的同等位置取下面积相同的耳片，并用电子分析天平称量，记录双耳重量，计算差值。将右耳皮肤组织固定于中性甲醛中，8％硝酸脱钙液处理2天后，用于后续实验。

④HE染色及观察

将固定的右耳皮肤组织从固定液中取出，随后进行组织脱水、包埋，在切片机中制成5μm厚度的组织切片，随后进行HE染色。切片组织脱蜡后，进行苏木素-伊红染色，随后脱水透明后封片。使用光学显微镜观察耳组织的病理变化，包括表皮和真皮水肿程度、淋巴细胞浸润等情况。

⑤胸腺指数和脾脏指数

取下各组小鼠的胸腺和脾脏，使用电子天平精密称重，计算胸腺指数和脾脏指数，公式分别为：

胸腺指数(mg/g)＝胸腺重量(mg)/小鼠体重(g)

脾脏指数(mg/g)＝脾脏重量(mg)/小鼠体重(g)

⑥血清中IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-6及IL-4表达水平检测

小鼠在末次激发的24h后通过眼球取血1.0ml，室温静置1h后，使用低温离心机以3000r/min的速度离心10min，吸取上层血清置于EP管中，并于-20℃冰箱中保存。参照ELISA试剂盒说明书的方法测定小鼠血清中IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-6和IL-4浓度值。

以上实验结果使用SPSS19.0进行统计分析，服从正态分布的数据用平均值±标准差(Mean±S.D.)表示，多组独立样本之间的比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，选择LSD分析方差齐性数据，选择Tambane’s T2分析方差不齐性数据，各组之间检验的显著性水平均设定为p<0.05。

研究结果见表15-19、图10-11。

研究结果显示，与空白组相比，模型组耳变应反应评分显著升高、小鼠耳厚度差及耳肿胀度显著增加(表15-19)；耳片结缔组织中出现明显炎性细胞浸润(图11)；脾脏指数显著增加(表18)；血清中IFN-γ、IL-2和TNF-α表达显著降低(表19)，而IL-6和IL-4浓度显著增加。与模型组相比，青蒿软膏低、中剂量组从d15天开始，能够明显降低这种由DNCB致敏引起的天耳变应反应评分、耳厚度差及耳肿胀度的升高；以及显著改善DNCB致敏引起的耳片组织中炎性细胞浸润减轻；并显著抑制脾脏指数的升高，以及抑制由DNCB致敏导致的血清中IFN-γ、IL-2和TNF-α浓度水平降低，并降低由DNCB致敏引起的IL-6和IL-4浓度升高。综上所述，青蒿富提取物软膏对湿疹具有显著的治疗作用，其机制可能与调节细胞免疫，抑制炎症反应有关。

表15青蒿软膏对小鼠耳变应反应评分的影响(Mean±S.D.)

注：

表16青蒿软膏对小鼠耳厚度差的影响(Mean±S.D.)

注：

表17青蒿软膏对DNCB致小鼠耳肿胀的影响(Mean±S.D.)

注：

表18青蒿软膏对小鼠脏器指数的影响(Mean±S.D.)

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注：

表19青蒿软膏对血清中炎症因子表达的影响(Mean±S.D.)

注：

通过上述实施示例发现，本发明的青蒿富倍半萜提取物具有良好的体内、外抗炎活性，在体外还能够抑制痤疮丙酸杆菌的增殖。且其制备的外用制剂能够显著改善湿疹小鼠的症状，进一步启发，青蒿富倍半萜提取物外用制剂，可能通过抗炎而发挥改善炎症性皮肤病患者的皮肤健康状况的作用，从而起到祛痘及祛斑美白等多重功效。

以上实施例对本发明的产品及方法进行了详细介绍，本文中应用了具体例对本发明的主要步骤及实施方式进行了阐述，上述实施例只是帮助理解本发明的方法及核心原理。对于本领域的技术人员，依据本发明的核心原理，在具体实施中会对各条件和参数根据需要而变动，综上所述，本说明书不应理解为对本发明的限制。