G6PD敲减肺癌A549稳转细胞株及其应用

摘要

本发明公开了一种G6PD敲减肺癌A549稳转细胞株及其应用。本发明筛选的G6PD敲减肺癌A549稳转细胞株，其保藏编号为：CCTCCNO:C2021172。另提供一种用Puromycin筛选所述G6PD敲减肺癌A549稳转细胞株的方法，还提供一种用G418筛选所述G6PD敲减肺癌A549稳转细胞株的方法。进一步将所述G6PD敲减肺癌A549稳转细胞株在调控A549细胞戊糖磷酸代谢中和调控A549细胞G6PD表达中应用。本发明的G6PD基因敲减的人肺癌A549‑G6PDΔ稳转细胞株，可作为用于研究G6PD与肺癌肿瘤的相关性及致病机理的试验模型，可用于从G6PD及肿瘤细胞戊糖磷酸代谢角度探索人肺癌发生发展的机制。

说明书

技术领域

本发明涉及医学分子生物学技术领域，具体涉及一种G6PD敲减肺癌A549稳转细胞株及其应用。

背景技术

肺癌(lung cancer，LC)是最常见的恶性肿瘤之一，也是全球最致命的癌症，约占所有癌症死亡人数的18.4％。而非小细胞肺癌约占LC的85％，且在诊断时大约75％的患者处于中晚期，五年生存率非常低。临床上肺癌治疗多以手术、化疗和放疗为主，近年来虽已取得显著进展，但是，目前仍然存在生存率低和副作用强等缺陷。

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)是戊糖磷酸途径的第一个酶，也是该途径的限速酶，催化来自糖酵解通路中的葡萄糖-6-磷酸，进行氧化脱氢，生成6-磷酸葡萄糖酸-δ-内脂和提供还原氢的NADPH。由于G6PD处在代谢通路中导致核酸合成的关键位置，很早就有假设提出认为G6PD缺陷会干扰正常的细胞功能和复制并会对癌症的发展起保护作用，即G6PD的抑制能够阻止细胞分化和增殖。Board等对一系列细胞系研究发现相比于正常细胞，肿瘤细胞中的G6PD表现出更高活性[Board,M.,S.Humm,and E.A.J.B.J.Newsholme,Maximumactivities of key enzymes of glycolysis,glutaminolysis,pentose phosphatepathway and tricarboxylic acid cycle in normal,neoplastic and suppressedcells.1990.265(2):p.503-509.]。

近年来，在肺癌、黑色素瘤、白血病、结肠癌、子宫内膜癌、乳腺癌、鼻咽癌等许多肿瘤中都发现G6PD高表达。Ryo Nagashio等研究指出G6PD过表达与肺癌患者病理TNM分期显著相关，过表达G6PD阳性患者的生存率明显低于未过表达者，同时多变量分析显示G6PD的表达是一个独立的不良预后因素[Nagashio,R.,et al.,Prognostic significance ofG6PD expression and localization in lung adenocarcinoma.2019.1867(1):p.38-46.]。Li Danyi等通过shRNA逆转录病毒表达靶向沉默了人黑色素瘤A357细胞的内源性G6PD，从而降低了该肿瘤细胞的增殖，诱发凋亡[Li,D.,et al.,A New G6PD KnockdownTumor-Cell Line with Reduced Proliferation and Increased Susceptibility toOxidative Stress.2009.24(1):p.81-90.]。

因此，为了深入探索肺癌的发生机制，寻找肺癌新的治疗靶点，为患者临床治疗奠定坚实的基础，对肺癌细胞进行基因改造是十分必要的。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种G6PD敲减肺癌A549稳转细胞株及其应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

筛选一种G6PD敲减肺癌A549稳转细胞株，其保藏编号为：。

优选的，其基因组包括干扰RNA的序列；

所述干扰RNA的序列为：AGCGACGACGATGATGGGCT。

另提供一种用Puromycin筛选所述G6PD敲减肺癌A549稳转细胞株的方法，所述Puromycin的浓度为0.3-0.4μg/ml。

优选的，其特征在于，所述Puromycin的浓度为0.35μg/ml。

另提供一种用G418筛选所述G6PD敲减肺癌A549稳转细胞株的方法，所述G418的浓度为600-800μg/ml。

优选的，所述G418的浓度为700μg/ml。

进一步将所述G6PD敲减肺癌A549稳转细胞株在调控A549细胞戊糖磷酸代谢中和调控A549细胞G6PD表达中应用。

本发明所述的G6PD敲减肺癌A549稳转细胞株已于2021年10月18日保藏在中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，地址为湖北省武汉市武昌区珞珈山(八一路299号)武汉大学中国典型培养物保藏中心，该G6PD敲减肺癌A549稳转细胞株在保藏中心的保藏编号为CCTCCNO:C2021172。

与现有技术相比，本发明的主要有益技术效果在于：

为深入研究肺癌发生发展机制和寻找有效治疗方法，本发明采用shRNA和逆转录病毒载体技术构建G6PD基因敲减的人肺癌A549-G6PDΔ稳转细胞株，并对其G6PD表达进行了初步探讨。

本发明筛选得到的G6PD敲减肺癌A549稳转细胞株可作为用于研究G6PD与肺癌肿瘤的相关性及致病机理的试验模型，可用于从G6PD及肿瘤细胞戊糖磷酸代谢角度探索人肺癌发生发展的机制。

附图说明

图1为A549细胞转染G6PD shRNA荧光拍照(10×10)；

图2为A549-G6PDshRNA筛选后荧光拍照(10×10)；

图1和图2中，A为荧光视野下的克隆细胞株，B为明视场下的克隆细胞株，C为A和B视场的重叠图；

图3为总RNA电泳图；

图4为G6PD的扩增曲线；

图5为G6PD的熔解曲线；

图6为18srRNA的扩增曲线；

图7为18srRNA的熔解曲线；

图8为QRT-PCR检测转染后的重组载体干扰效率统计图；

图9为Western blot检测瞬时转染后稳转细胞株的SDS-PAGE电泳图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。

以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。

以下实施例中所涉及的人肺癌A549细胞株购自广州莱德尔生物科技有限公司。A549细胞系是1972年由D.J.Giard等人通过对一名58岁男性的腺癌肺组织的外植体培养而建立的，是人肺泡基底上皮细胞，在体外呈单层贴壁生长，可作为合适的转染宿主。

实施例一：构建G6PD缺陷型A549稳转细胞株

(1)设计干扰载体及shRNA模板

选取Lipofectamine 2000作为干扰载体(invitrogen，Cat.No.11668019)作为干扰载体。根据pcDNA3.1+G6PD设计表达G6PDshRNA序列的DNA模板，DNA序列包括：正义和反义干扰序列、9个核苷酸的Loop结构以及两端限制性内切酶BglⅡ和HindⅢ的酶切位点。

根据人G6PD基因和Lipofectamine 2000载体的信息，利用BLOCK-iT

具体碱基序列为：

siRNA1：TTCTGCTCGACTACTTC；

siRNA2：AGCGACGACGATGATGGGCT；

siRNA3(对照)：CGGAGTCACGGTGAACTG。

(2)脂质体感染A549细胞

1)A549细胞复苏

用37℃水浴迅速解冻细胞，过程中注意要不断摇动，在冰冻管内残存一点点未融化时取出，放入超净台内。制备细胞悬液，将细胞转移至15ml离心管内，一滴一滴加入预热好的培养基，同时一边晃动离心管；加入培养基的量要达到10ml以上，离心(800rpm,5min)，吸去上清，用1ml培养基重悬细胞；将细胞悬液分装入培养皿内，37℃含CO

2)A549细胞培养

取出细胞用PBS洗涤细胞一至二次，加入trypsin-EDTA溶液(1ml/25cm

3)杀伤曲线检测

第一天将人肺癌细胞A549各铺于96孔板，第二天加不同浓度的Puromycin(Puromycin Dihydrochloride，thermo公司提供，货号：A11138-03)于细胞上,0.05μg/ml、0.10μg/ml、0.15μg/ml、0.20μg/ml、0.25μg/ml、0.30μg/ml、0.35μg/ml、0.40μg/ml、0.45μg/ml、0.50μg/ml每个浓度6个平行孔(边缘孔不使用)。观察一周，中间换一次液。

人肺癌细胞A549到7天0-0.35μg/ml的Puromycin浓度细胞有不同孔数细胞存活，0.40-0.50μg/ml的Puromycin浓度的细胞部分死亡。选择0.35μg/ml的Puromycin浓度为人肺癌细胞A549的筛选浓度。

接着在0.35μg/ml的Puromycin再加不同浓度的G418(Geneticin

人肺癌细胞A549到7天0-600μg/ml的G418浓度细胞有不同孔数细胞存活，700-1000μg/ml的G418浓度的细胞部分死亡。人肺癌细胞A549选择700μg/ml的G418浓度为筛选浓度。

4)Lipofectamine 2000介导siRNA瞬时转染A549-WT细胞

分别将siRNA1、siRNA2和对照siRNA3双链片段插入含GFP绿色荧光的Lipofectamine 2000表达载体，得重组干扰载体。

用胰酶消化处于生长对数期的A549细胞，用无抗生素的培养基重悬细胞，并进行细胞计数。转染前一天对细胞株进行传代，使其汇合度为70％-80％，转染采用Lipofectamine 2000(invitrogen，Cat.No.11668019)转染试剂，转染时使用Opti-MEM(invitrogen，Cat.No.31985070)培养基。使用24孔板，每孔用量：每孔加入1ug siRNA，稀释到100ul Opti-MEM培养基为A液，取1ul Lipofectamine 2000溶解于Opti-MEM培养基为B液，B液混合5分钟后，A液和B液混合，静止20分钟后加到细胞培养板中。孵育4-6小时后换为细胞生长培养基。

细胞生长培养基中添加0.35μg/ml的Puromycin和700μg/ml的G418筛选人肺癌细胞A549。

5)筛选阳性克隆

将每组筛选的转染A549-WT细胞培养在6cm或10cm培养板内，在酒精灯火焰上将玻璃吸管口端拉细，然后将尖细的末端烧结成细小的圆球状。先从四周轻轻推开克隆边缘，然后使整个克隆脱离培养板底部。

荧光显微镜观察转染细胞的GFP表达，如图1所示，图中A为荧光视野下的克隆细胞株，B为明视场下的克隆细胞株，C为A和B视场的重叠图。其中绿色荧光细胞株为阳性克隆。

挑取有绿色荧光的细胞株克隆，加入20ul酶消化为单细胞在96孔板单细胞接种，即将消化的单细胞做连续10稀释，当达到每100ul培养基含1个细胞的浓度时，在每个孔内加100ul即可，这样每孔都会有1个细胞，进行细胞扩增。

荧光显微镜观察扩增转染细胞的GFP表达，如图2所示，图中A为荧光视野下的克隆细胞株，B为明视场下的克隆细胞株，C为A和B视场的重叠图，图中扩增细胞均表达有绿色荧光。

至此，筛选得siRNA1、siRNA2和对照siRNA3分别转染的稳转细胞株，分别命名为A549-si-1稳转细胞株，A549-si-2稳转细胞株，A549稳转细胞株。

实施例二：鉴定G6PD缺陷型A549稳转细胞株

(1)荧光定量PCR(QRT-PCR)检测瞬时转染后重组载体的干扰效率

1)总RNA抽提

分别收集三组稳转细胞株细胞，加入1ml Trizol(Invitrogen)溶液，吹打混匀，使细胞充分裂解，静置5min；加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置2min；4℃下，14,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管；加入等体积的异丙醇，轻柔地充分混匀，室温静置10min沉淀RNA；4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀，去上清，用75％乙醇洗涤两次，超净台风干，加入60μlDEPC水溶解沉淀。

2)去基因组RNA抽提

使用RNase-free的DNaseI(Promega)，具体为依次加入RNA20μl，DNaseI20μl，10×buffer 10μl，RNA酶抑制剂0.5μl，加入无霉无菌缓冲体液49.5μl补足100μl。37℃消化30min，65℃灭活10min；加入等体积的苯酚，上下颠倒混匀后10,000rpm，离心5min，取上清；加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀后10,000rpm，离心10min，取上清；加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀，-20℃静置15min，4℃下，10,000g离心10min，收集RNA沉淀，去上清；用75％乙醇洗涤两次，超净台风干；加入15-40μlDEPC水溶解沉淀。

3)总RNA纯度和完整性检测

a.纯度检测：取1μl RNA样品50倍稀释，在BioPhotometer plus艾本德核酸蛋白测定仪上测定OD值，OD

b.总RNA完整性检测：取RNA样品1μl，1％琼脂糖凝胶电泳80V×20min，用凝胶成像系统观察

如图3所示，A549-si-1稳转细胞株(泳道2)，A549-si-2稳转细胞株(泳道3)，A549稳转细胞株(泳道1)细胞所提取的总RNA的5s rRNA，18s rRNA和28s rRNA条带完整，即各组证明各组细胞株的总RNA抽提比较完整。

4)逆转录合成cDNA

分别在RNase free的PCR管中取各组总RNA 1μg，用Reverse Transcriptase M-MLV逆转录酶，按说明合成cDNA。具体步骤：先在总RNA中加入0.5μl随机引物，加水(DEPC处理)补足至12μl，吹打均匀，85℃保温5min，使RNA变性后，冰浴急冷2min，以防止RNA复性。依次加入RNA酶抑制剂0.5μl，Oligo(dT)0.5μl，dNTP Mixture(各10mM)2μl，5×M-MLV Buffer4μl，RTase M-MLV(200U/μl)0.5μl，加水(DEPC处理)补足至20μl，30℃反应10min，再42℃保温60min，最后85℃保温10min灭活反转录酶。

5)荧光定量PCR

设计引物：

G6PD-F：5’CACTGCTGCACCAGATTGA；

G6PD-R：5’TAGGTGCCCTCATACTGGAA；

18srRNA-F：5’CCTGGATACCGCAGCTAGGA；

18srRNA-R：5’GCGGCGCAATACGAATGCCCC。

按说明书配置反应体系，上机进行PCR扩增和检测。设定内参片段为18srRNA-112bp，目的片段为G6PD-121bp。反应总体积为20μl，具体是cDNA以1：20稀释到5μl，上下游引物各0.5μl，2×SYBR Green qPCR SuperMix10μl，用灭菌水补足20μl体系。反应条件50℃、95℃2min预变性，循环内95℃15s变性，60℃退火32s，PCR反应设置40个循环，并在每个循环延伸末收集荧光信号，绘制扩增曲线；并且对60℃到95℃升温过程进行全程荧光信号收集，绘制融解曲线。每组样品重复3次。用Bio-Rad CFX Manager version 1.6软件进行数据分析。

结果如图4至图8所示：G6PD的扩增曲线如图4所示，G6PD的熔解曲线如图5所示；作为内参，18srRNA的扩增曲线如图6所示，18srRNA的熔解曲线如图7所示。转染后的重组载体干扰效率的数据分析如图8所示，与A549稳转细胞株相比，A549-si-1稳转细胞株中G6PDmRNA表达下降27％，A549-si-2稳转细胞株中G6PD mRNA表达下降37％。

(2)Western blot检测瞬时转染后重组载体的干扰效率

1)细胞总蛋白提取

收集A549-si-2稳转细胞株细胞培养于6孔板中，当细胞汇合度达到约80％时，1000rpm离心10分钟，弃培养液，预冷的1×PBS溶液1ml清洗细胞1次；再次1000rpm离心5分钟，弃上清，PBS溶液清洗；第三次1000rpm离心5分钟，吸去PBS溶液。根据细胞量加入相应的提取缓冲液，4℃轻摇15min。收集蛋白裂解液于EP管中，14000rpm离心15min后取上清到新的EP管中。取少量蛋白裂解液用于总蛋白定量，其余提取好的样品的蛋白裂解液和上样缓冲液按2:1混合(含0.01％w/v溴酚蓝)，100℃沸水浴5min变性。

2)蛋白样品初步定量

BCA法测量蛋白浓度。

3)SDS-PAGE电泳

准备蛋白上样缓冲液，凝胶电泳前，每孔均用1×电泳缓冲液清洗。上、下层电泳槽中加入1×电泳缓冲液，上层槽中缓冲液液面需超过上样孔顶端。80V恒压50min，120V恒压电泳至溴酚蓝刚出胶片底部。

4)蛋白质转移

PVDF膜(Immobilon-P Transfer Membrane，MILLIPORE，IPVH00010，0.45μm)甲醇预处理3-5s，放至转印液浸润30min后，取出凝胶，将其放至在滤纸上，形成凝胶转印堆积层：滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、凝胶转印堆积层这样的“三明治”结构(此操作需将气泡完全去除)。按正负极方向放置转印夹，在低温条件下，100V恒压60-120min。

5)免疫印记

取杂交膜，TBST漂洗5min，共3次。用5％脱脂羊奶粉溶液室温封闭60min或4℃过夜。将TBST洗膜5min，共3次，加入合适的一抗稀释浓度液(1:1000稀释)4℃过夜或37℃孵育2h；再将TBST洗膜5min，共3次，加入相应二抗稀释液37℃孵育1h；第三次TBST洗膜5min，共3次，后蒸馏水漂洗膜2min，弃去液体，共洗三次。将杂交膜置于一透明塑料板上，注意不要让膜干燥，用一干净移液器将化学荧光发光底物均匀地加到膜的表面，并使反应持续5min。用试剂盒提供的滤纸吸去膜表面多余的底物溶液，放至暗盒，显影，用Bio-Rad Quantity One4.6.2软件对胶片进行灰度分析。HRP标记的GAPDH(稀释倍数：1:10,000，上海康成生物，KC-5G5)作为内参。

结果如图9所示：与A549稳转细胞株相比，A549-si-2稳转细胞株中G6PD蛋白表达下降90％。

综上所述，本发明将A549细胞株经shRNA-脂质体表达系统靶向沉默了内源性G6PD的表达，并将设计的siRNA序列整合到A549细胞基因组，筛选阳性细胞克隆后，通过荧光定量PCR和Western Blot检测G6PD mRNA和蛋白表达，较A549细胞分别下降37％和90％，干扰效率达到预期，G6PD敲减的A549-G6PDΔ稳转细胞株构建成功。

即，本发明经阳性细胞克隆筛选，shRNA靶向沉默了37％的内源性G6PD的表达量，且90％以上的细胞表达绿色荧光蛋白的稳转细胞株。

本发明的RNAi技术在生物体细胞内,将内源性的双链RNA引起同源mRNA特异性的降解,从而抑制目的基因表达，与传统的反义核酸技术相比，具有特异性强、针对性强、级联放大等优点。本发明将脂质体作为体内和体外输送载体的工具，使用脂质体将DNA带入人肺癌A549细胞株，有较高的效率。脂质体转染无免疫和突变风险，转染效果稳定，且Lipofectamine2000转染步骤快速简洁，中性脂质体利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。即，本发明通过构建A549-G6PDshRNA重组载体并生成阳离子脂质体感染A549细胞，携带G6PD-shRNA的DNA模板进入细胞质，在Dicer酶作用下被切割成G6PD-siRNA，在进一步入核内转录、表达，最终整合至A549细胞基因组。G6PD-shRNA自身形成发卡结构，能稳定介导靶基因的表达下降。

本发明将A549-si-2稳转细胞株命名为敲减G6PD的人肺癌A549稳转细胞株，于2021年10月18日保藏在中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，地址为湖北省武汉市武昌区珞珈山(八一路299号)武汉大学中国典型培养物保藏中心，该G6PD敲减肺癌A549稳转细胞株在保藏中心的保藏编号为CCTCC NO:C2021172。

上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。