泛素连接酶E6AP敲减及过表达稳转细胞株的构建与鉴定

摘要

目的旨在筛选出能稳定敲减及过表达泛素连接酶E6AP的细胞株,在这两种情况下比较已知底物Arc的泛素化修饰区别,以期进一步阐明E6AP通过调控底物的泛素化进而影响底物下游功能的机理。方法从人胚肾293细胞中提取RNA再反转录成cDNA,以c DNA为模板通过PCR扩增得到E6AP目的条带,将E6AP基因克隆至p LVXIRES-mCherry质粒,构建过表达质粒;同时,合成可特异性结合E6AP mRNA的shRNA,并克隆至GIPZ质粒,构建敲减质粒。结果通过嘌呤霉素筛选得到敲减及过表达稳转细胞株,通过免疫共沉淀实验比较底物的泛素化修饰区别。结论成功构建E6AP敲减及过表达稳转细胞株,并能相应影响HEK-293细胞中底物Arc的泛素化修饰水平。