单核细胞增生李斯特菌P60单克隆抗体及免疫磁珠和用途

摘要

本发明涉及生物技术领域，公开了单核细胞增生李斯特菌P60单克隆抗体及免疫磁珠和用途。单核细胞增生李斯特菌P60蛋白杂交瘤细胞株12A5H5F8，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.23021，产生的单克隆抗体和纳米磁珠偶联得到了单核细胞增生李斯特菌P60单克隆抗体免疫磁珠。单核细胞增生李斯特菌P60蛋白杂交瘤细胞株12A5H5F8，可以产生可以特异性识别LM分泌的P60蛋白的单克隆抗体，由该单克隆抗体制备的免疫磁珠可以特异性的捕获LM，而且对食品和环境中痕量细菌有很高的灵敏性，具有特异性好、灵敏度高、稳定性好等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及单核细胞增生李斯特菌P60单克隆抗体及免疫磁珠和用途。

背景技术

食品安全与人们的日常生活以及身体健康息息相关，近年来随着人们生活水平的提高，进口冷冻冷藏生肉、冰鲜水产品、乳粉等越来越多，但质监部门不断从这些产品中检测出多种致病微生物，例如从虾蟹贝类中检出相对较高的副溶血性弧菌，检出率高达26.92％，从13.35％的猪肉和7.87％的鱼类中检测出单增李斯特菌，这些都提醒我们发展食源性致病菌快速检测技术刻不容缓。

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是危害最大的食源性致病菌之一，占人类李斯特菌病的95％以上。LM是一种机会性病原菌，能迅速感染并扩散到宿主血液系统，导致脑膜炎、败血症或流产等严重疾病，在免疫功能低下人群、老年人、儿童和孕妇等高危人群中尤其危险，而食用受污染的食品(乳制品，生肉和蔬菜)仍然是造成感染的主要原因。鉴定活菌细胞和评估食品微生物质量的“金标准”是平板计数法，这种方法分析时间长，无法满足当前食品行业对快速和高通量技术的需求。现在，基于分子生物学的PCR技术，免疫学的ELISA方法等已成为快速检测的替代方法。另外，病原菌的全基因组测序(WGS)也已成为调查食源性疾病暴发的重要工具，一些国家已将WGS纳入国家食品控制系统。

免疫磁珠分离技术(Immunomagnetic separation，IMS)是利用抗原抗体特异性结合的特点，以磁性微球为载体偶联抗体，抗原抗体反应后，在定向磁场的作用下快速分离并富集抗原的技术。IMS可以提升上游目的抗原(如致病菌、细胞因子等)的浓度，降低原有检测方法的检测限，提高检测方法的灵敏度，可以与传统平板计数、免疫检测、生化技术等结合，是食品中LM检测的有效辅助手段。IMS开发的重点是区分样品中LM和其它病原菌或者非致病性李斯特菌，提高LM富集的敏感性和选择性。为了实现更特异的检测，与细菌致病性相关的主要毒力因子：李斯特菌溶血素O(LLO)和P60蛋白，是首选的LM检测靶标。P60蛋白是LM细胞表面特异性的蛋白，在宿主入侵、细胞分裂和繁殖中起着重要作用，除此之外，P60蛋白还可以大量分泌到生长介质中。这些特性使P60成为开发免疫检测系统的理想靶点。

关于LM中P60蛋白及其抗体的应用包括：ELISA和免疫荧光，例如CN104178458A、CN105527441A、DE4318450A1、JP2006104154A、US2006078951A1、KR100504132B1、KR1020040088597A、US5932415A；胶体金试纸条，例如CN103911347 A、CN202710560 U、CN201548546 U、CN101609095A、CN101561436A、CN106093410A、EP0576842A2、JPH06233699A；基于生物素化P60蛋白单抗的A-BELISA检测和定量方法，例如CN104099299A；疫苗制备，例如CN101698100A、CA2817495A1、EP1708741B1、KR20090092803A、US9605251B2；癌症治疗，例如CN110913911A、WO2011060093 A3；重组核酸分子和表达试剂盒，例如CN1921884A、JP2007518405A、JP2007518405A、US20090081725A1；RNA药物组合物，例如CN108778308A、EP3319622A1、US20100172976 A1。

目前，还没有关于P60蛋白单克隆抗体制备的免疫磁珠用于LM捕获和富集的报道。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的上述问题，提供单核细胞增生李斯特菌P60单克隆抗体及免疫磁珠和用途。

为了实现上述目的，本发明一方面提供一种单核细胞增生李斯特菌P60蛋白杂交瘤细胞株12A5H5F8，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23021。

本发明第二方面提供一种单核细胞增生李斯特菌P60单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCC No.23021的单核细胞增生李斯特菌P60蛋白杂交瘤细胞株12A5H5F8产生的。

本发明第三方面提供上述单核细胞增生李斯特菌P60单克隆抗体的用途，它被用于检测单核细胞增生李斯特菌，所述用途用于非疾病诊断目的。

本发明第四方面提供一种单核细胞增生李斯特菌P60单克隆抗体免疫磁珠，由纳米磁珠和上述单核细胞增生李斯特菌P60单克隆抗体通过偶联得到。

本发明第五方面提供一种单核细胞增生李斯特菌P60单克隆抗体免疫磁珠的制备方法，所述方法包括以下步骤：

b1：将上述P60单克隆抗体与活化的纳米磁珠进行混合，接着加入pH＝6的MES缓冲液进行混合，然后置于旋转混合器上室温反应1h，接着置于磁力架上进行磁分离并移除上清；

b2:向步骤b1中磁分离得到的下层物料中加入含牛血清白蛋白的硼酸盐吐温溶液并且重悬磁珠，置于混匀仪上于37℃封闭；然后置于磁力架上磁分离并移除上清，接着用PBS缓冲液进行洗涤。

优选地，所述活化的过程包括如下步骤：

a1：采用一水吗啉乙磺酸吐温溶液对纳米磁珠进行洗涤，然后置于磁力架进行磁分离后吸出上清；

a2：用一水吗啉乙磺酸溶液分别配制碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺溶液。然后向步骤a1中洗涤后的纳米磁珠中加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺溶液，并在室温下搅拌；然后将混合物置于磁力架上磁分离移除上清，并加入一水吗啉乙磺酸溶液进行洗涤，然后置于磁力架磁分离，得到活化的纳米磁珠。

优选地，所述纳米磁珠的粒径为201.1-340.9nm。

优选地，在步骤b1中，P60单克隆抗体的浓度为2.5-3.5mg/mL。

优选地，在步骤b1中，所述活化的纳米磁珠与P60单克隆抗体的重量比为1:0.008-0.01。

本发明第六方面提供一种用于检测单核细胞增生李斯特菌的免疫磁珠试剂盒，所述试剂盒中含有上述单核细胞增生李斯特菌P60单克隆抗体免疫磁珠或由上述方法制备的单核细胞增生李斯特菌P60单克隆抗体免疫磁珠。

本发明筛选获得的单核细胞增生李斯特菌P60蛋白杂交瘤细胞株12A5H5F8，可以产生可以特异性识别LM分泌的P60蛋白的单克隆抗体，对其它重要致病菌金黄色葡萄球菌、大肠杆菌MG1655、铜绿假单胞菌PAO1没有交叉反应。由该单克隆抗体制备的免疫磁珠可以特异性的捕获LM，而且对食品和环境中痕量细菌有很高的灵敏性，具有特异性好、灵敏度高、稳定性好等优点，与传统平板计数、免疫检测、生化技术等结合，是LM快速检测的有效方法。

附图说明

图1是实施例1中P60

图2是实施例2中抗体的SDS-PAGE电泳检测结果；

图3是实施例3中制备的抗体对不同细菌的效价检测结果；

图4是实施例4中免疫磁珠捕获LM的特异性检测结果。

生物保藏

本发明的单核细胞增生李斯特菌P60蛋白杂交瘤细胞株12A5H5F8，于2021年08月20日递送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市北辰西路1号院3号)保藏，保藏单位的缩写为CGMCC，保藏编号为CGMCC No.23021。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明一方面提供一种单核细胞增生李斯特菌P60蛋白杂交瘤细胞株12A5H5F8，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23021。

杂交瘤细胞株12A5H5F8已于2021年08月20日递送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市北辰西路1号院3号)保藏，保藏编号为CGMCC No.23021。

本发明第二方面提供一种单核细胞增生李斯特菌P60单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCC No.23021的单核细胞增生李斯特菌P60蛋白杂交瘤细胞株12A5H5F8产生的。

本发明第三方面提供上述单核细胞增生李斯特菌P60单克隆抗体的用途，它被用于检测单核细胞增生李斯特菌，所述用途用于非疾病诊断目的。

本发明第四方面提供一种单核细胞增生李斯特菌P60单克隆抗体免疫磁珠，由纳米磁珠和上述单核细胞增生李斯特菌P60单克隆抗体通过偶联得到。

本发明第五方面提供一种单核细胞增生李斯特菌P60单克隆抗体免疫磁珠的制备方法，所述方法包括以下步骤：

b1：将权利要求2所述的P60单克隆抗体与活化的纳米磁珠进行混合，接着加入MES缓冲液进行混合，然后置于旋转混合器上室温反应，接着置于磁力架上进行磁分离并移除上清，然后检测上清中剩余抗体的量，以确定抗体与磁珠偶联的偶联效率；偶联效率＝(抗体总质量-上清中抗体质量)/抗体总质量×100；

b2:向步骤b1中磁分离得到的下层物料中加入含1％牛血清白蛋白的硼酸盐吐温溶液并且重悬磁珠，置于混匀仪上37℃封闭；然后置于磁力架上磁分离并移除上清，接着用PBS缓冲液进行洗涤。

在优选的实施方式中，在步骤b1中，P60单克隆抗体的浓度为2.5-3.5mg/mL。

在优选的实施方式中，在步骤b1中，所述活化的纳米磁珠与P60单克隆抗体的重量比为1:0.008-0.01。

在优选的实施方式中，所述活化的过程包括如下步骤：

a1：采用一水吗啉乙磺酸吐温溶液对纳米磁珠进行洗涤，然后置于磁力架进行磁分离后吸出上清；

a2：用一水吗啉乙磺酸溶液分别配制碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺溶液。然后向步骤a1中洗涤后的纳米磁珠中加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺溶液，并在室温下搅拌2h；然后将混合物置于磁力架上磁分离移除上清，并加入一水吗啉乙磺酸溶液进行洗涤，然后置于磁力架磁分离，得到活化的纳米磁珠。

在优选的实施方式中，在步骤a1中，所述纳米磁珠(Fe

以下将通过实施例对本发明进行详细描述，但本发明的保护范围并不局限于此。

实施例中使用的纳米磁珠购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司(货号：S8038-A300nm)。

实施例1单核细胞增生李斯特菌P60融合蛋白的构建、纯化与鉴定

(1)蛋白构建：P60蛋白是LM特异性的细胞壁水解酶，由iap基因编码，基因全长1449bp，编码374个氨基酸，本实施例选用其中具有抗原决定簇的上游基因序列，采用高保真Pfu DNA聚合酶PCR扩增，连接pGEM-Tvector(GenStar)，转化DH5α感受态细胞，菌落PCR挑选阳性克隆，提质粒后测序验证。酶切pET30a质粒以及测序正确的pGEM-T::P60质粒，回收目的基因片段和pET30a载体并连接，转化DH5α感受态细胞，菌落PCR挑选阳性克隆，提质粒并酶切验证。电击转化pET30a::P60质粒到蛋白表达菌株Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞，加500μL液体LB培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L)，37℃，180rpm孵育1hr，涂布在卡那霉素抗性LB固体平板上，37℃培养16hr得到蛋白表达菌株；

其中，PCR所用引物和酶切位点如表1所示；

表1

PCR产物702bp，扩增片段全长为：

CATATGTGGAGCCACCCGCAGTTCGAAAAGGTAGTCGAAGCTGGTGATACTCTTTGGGGTATCGCACAAAGTAAAGGGACTACTGTTGACGCAATTAAAAAAGCAAACAATTTAACAACAGATAAAATCGTACCAGGTCAAAAATTACAAGTAAATAATGAGGTTGCTGCTGCTGAAAAAACAGAGAAATCTGTTAGCGCAACTTGGTTAAACGTCCGTAGTGGCGCTGGTGTTGATAACAGTATTATTACGTCCATCAAAGGTGGAACAAAAGTAACTGTTGAAACAACCGAATCTAACGGCTGGCACAAAATTACTTACAACGATGGAAAAACTGGTTTCGTTAACGGTAAATACTTAACTGACAAAGCAGTAAGCACTCCAGTTGCACCAACACAAGAAGTGAAAAAAGAAACTACTACTCAACAAGCTGCACCTGCTGCAGAAACAAAAACTGAAGTAAAACAAACTACACAAGCAACTACACCTGCGCCTAAAGTAGCAGAAACGAAAGAAACTCCAGTAGTAGATCAAAATGCTACTACACACGCTGTTAAAAGCGGTGACACTATTTGGGCTTTATCCGTAAAATACGGTGTTTCTGTTCAAGACATTATGTCATGGAATAATTTATCTTCTTCTTCTATTTATGTAGGTCAAAAGCTTGCTATTAAACAAACTGCTAACACAGCTACTCTCGAG(如SEQ.ID.NO:3所示)。

(2)蛋白诱导：挑取构建成功的蛋白表达菌株单克隆细胞于10mL含卡那霉素抗性的LB培养基中，37℃，220rpm培养过夜，作为种子菌液。将种子菌液按1％接菌量扩大培养至300mL LB培养基中。37℃，220rpm培养至OD600nm≈0.4，冰上预冷10min，加入终浓度为0.5mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导，16℃，160rpm培养16hr。

(3)蛋白纯化：4℃，6000g离心10min收集菌体，按每克菌体4mL缓冲液W的用量重悬菌体(缓冲液W：100mM Tris-HClpH 8.0，150mM NaCl，1mM EDTA，0.1mM PMSF)。冰浴条件下超声裂解细胞，12000g离心30min收集可溶性蛋白组分。用缓冲液W平衡Strep-

(4)蛋白鉴定：配制SDS-PAGE胶(15％分离胶，5％浓缩胶)。分别取10μL浓缩前蛋白和1～2μL浓缩后P60融合蛋白，定容至20μL，加5μL 5×SDS loading缓冲液(250mM Tris-HClpH 6.8，50％甘油，10％SDS，0.5％溴酚蓝，5％β-巯基乙醇)，沸水浴5min，离心12000g。取20μL上清液加入到SDS-PAGE胶，120V电压电泳2hr，剥离胶，染色(450mL/L ddH

本实施例中PCR上游引物的TGGAGCCACCCGCAGTTCGAAAAG序列编码8个氨基酸WSHPQFEK，这8个氨基酸构成Strep-tag，能结合到链霉亲和素树脂的生物素结合口袋，当用50mM biotin洗脱树脂时，biotin与融合蛋白竞争链霉亲和素的结合口袋，随着biotin浓度的增加，融合蛋白结合位点逐渐被生物素取代，从而脱离树脂流出层析柱，流出液即是纯化蛋白。本实施例中得到的P60

实施例2单克隆细胞株的筛选和效价检测

(1)BALB/c小鼠免疫：选取实施例1得到的P60蛋白作为免疫原，与等体积的弗氏佐剂(Freund adjuvant，Sigma)混合均匀后，皮下注射免疫BALB/c小鼠，每隔4周免疫一次。首次免疫使用弗氏完全佐剂，每只小鼠腹部皮下足掌多点注射10μg抗原和0.2mL弗氏完全佐剂的混合液，免疫5只小鼠。随后使用弗氏不完全佐剂加强免疫，腹部皮下足掌多点注射10μg抗原和0.2mL弗氏不完全佐剂的混合液。2次加强免疫后采集小鼠尾血并用ELISA间接法检测尾血抗体浓度，OD>0.5即可融合。

(2)细胞融合与细胞株建立：分离来自免疫小鼠的脾细胞，将脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按照10:1的细胞数量混合，用无血清离心3次后用50％(w/v)PEG4000融合1min后静置90秒之后在2分钟之内按照从慢到快，加入RPMI-1640基础培养液，离心后重悬于含20％胎牛血清、2％50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，37℃，5％CO

间接ELISA筛选阳性细胞孔过程中，包被P60抗原浓度为2μg/mL，加入到ELISA板中100μL/孔，4℃过夜，次日用2％BSA-PBST封闭液封闭放入37℃温箱2hr入细胞上清液，PBST和细胞培养液为阴性对照，1000倍稀释的用于融合的小鼠眼眶血上清作为阳性对照，37℃温育1hr。加入HRP(辣根过氧化物酶)标记的羊抗小鼠IgG二抗(稀释度为1:10000)，37℃温育1hr，TMB底物显色后加入终止液测定吸光度值(A)。OD值大于1即为阳性

本实施例中，经3轮间接ELISA筛选，得到5个细胞孔的杂交瘤细胞具有阳性反应，分别为P60-12A10B8、P60-12D10F3、P60-12A5H5F8、P60-11H5D7D3、P60-4E1D1。

表2最后一次血清效价的测定

实施例3单克隆抗体的制备与特异性检测

(1)单克隆抗体的制备：取8～10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.2mL石蜡油，7天后腹腔注射1×10

粗提后的腹水经0.22μm过滤，用Protein G抗体纯化柱洗脱，得到纯化的小鼠单克隆抗体。单克隆抗体用PBS超滤离心(超滤离心管为30KDa)(Millipore)，6000rpm/min，30min，重复4～5次，去除盐离子及浓缩抗体。纯化后的单克隆抗体中加入0.02％的叠氮纳，分装后-20℃保存。

用SDS-PAGE胶(12％分离胶，5％浓缩胶)，上样电泳检测单克隆抗体蛋白的分子量，如图2所示。BCA蛋白测定试剂盒测定抗体浓度分别为：12A10B8：1.2mg/mL，12D10F3：1.3mg/mL，12A5H5F8：3.1mg/mL，11H5D7D3：3.6mg/mL，14E1D1：1.8mg/mL。

(2)单克隆抗体的效价检测：间接ELISA测定纯化的单克隆抗体效价，其中12A5H5F8效价最高，高于200000，11H5D7D3抗体效价大于50000，而12A10B8、12D10F3和14E1D1三株效价低(<10000)(表3)。

表3

(3)单克隆抗体亲和力常数的测定：包被抗原是纯化的P60融合蛋白，蛋白浓度分别为0.5、0.25μg/mL，加入到ELISA板中，每孔100μL，37℃，包被2hr，3％BSA封闭液37℃封闭2hr。封闭后将单抗从2.5μmol/L开始倍比稀释，按间接ELISA方法，加入HRP标记的二抗，TMB底物显色后，测定两种包被浓度下不同抗体浓度的OD490值。作图计算OD490值在50％处对应的抗体浓度，根据公式计算单克隆抗体亲和力常数：

Ka＝(n-1)/2(n×Ab1-Ab2)，n＝Ag2/Ag1

其中：Ag1、Ag2为包被抗原的质量浓度(μg/mL)；Ab1、Ab2为相应抗原包被浓度下OD490值50％处对应的抗体摩尔浓度(mol/L)。

亲和常数测定结果显示，5株抗体的亲和力大小为12A5H5F8>11H5D7D3>12D10F3>14E1D1>12A10B8，亲和力常数分别为：2.09×10

根据以上结果，筛选出P60单克隆抗体杂交瘤细胞株12A5H5F8，已于2021年08月20日递送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市北辰西路1号院3号)保藏，保藏编号为CGMCC No.23021。

(4)单克隆抗体的特异性检测：特异性检测使用的菌种均已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC。

间接ELISA法检测抗体的特异性，ELISA包被的抗原有金黄色葡萄球菌NCTC8325(Staphylococcus aureus NCTC 8325，保藏号：CGMCC1.19138)、铜绿假单胞菌PAO1(Pseudomonas aeruginosa PAO1，保藏号：CGMCC1.19139)、大肠杆菌MG1655(Escherichiacoli MG1655，保藏号：CGMCC1.19140)。培养过夜细菌用包被液调细胞数为1×10

本实施例中，间接ELISA测定结果表明，以P60融合蛋白为抗原制备的单克隆抗体12A5H5F8与P60蛋白和部分LM(Listeria-2W11，Listeria-1，LM-0260，YP-926，LM-0088，LM-0148，YP-897)有较高的特异性(图3)，而与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌无交叉反应，表明本实施例制备的P60单抗特异性较好。

实施例4免疫磁珠的制备和性能检测

纳米磁珠的活化：

a1：取10mg纳米磁珠至1.5mL离心管中，用500μL 0.01mol/L一水吗啉乙磺酸吐温溶液(MEST，pH6.0，0.05％Tween-20)洗涤三次，磁力架分离2min后吸出上清。

a2：用0.01mol/L一水吗啉乙磺酸溶液(MES，pH＝6.0)分别配制碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液。磁珠中分别加入100μL EDC(5mg/mL)和110μLNHS溶液(5mg/mL)，并在室温下搅拌2h。反应后，将混合物置于磁力架上，磁分离移除上清，加入500μLMEST洗涤2次，将磁珠转移至新的离心管中，磁力架分离2min后吸出上清，得到活化的磁珠备用。

偶联P60单克隆抗体的免疫磁珠制备：

b1:将20μL浓度为3.1mg/mL的P60单克隆抗体(共60.2μg)与活化的纳米磁珠(6.02mg)混合，用MES(pH＝6.0，0.01mol/L)调节总体积至500μL，旋转混合器上室温(25℃)反应1hr。将离心管取下置于磁力架上磁分离，移除上清。用BCA试剂盒在OD560下检测上清中剩余抗体的量，以确定抗体与磁珠偶联的偶联效率，经计算偶联效率为70％。(偶联效率＝(抗体总质量-上清中抗体质量)/抗体总质量×100)。

b2：向步骤b1得到的磁珠加入1mL 0.04mol/L含1％牛血清白蛋白(BSA)的硼酸盐吐温溶液(BST，pH＝9.0)重悬磁珠，置于混匀仪上37℃封闭1hr。将离心管取下置于磁力架上磁分离，移除上清，用500μL PBS洗涤四次；加入含0.02％(w/v)叠氮化钠NaN3、1％(w/v)BSA的PBS作为保存液，4℃保存备用。

免疫磁珠捕获LM的特异性检测：LB培养基培养过夜的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus NCTC 8325，保藏号：CGMCC1.19138)、大肠杆菌MG1655(Escherichia coli MG1655，保藏号：CGMCC1.19140)、铜绿假单胞菌PAO1(PseudomonasaeruginosaPAO1，保藏号：CGMCC1.19139)、单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes 2W11，保藏号：CGMCC 1.19180)，用无菌生理盐水10倍稀释菌体至10

金黄色葡萄球菌、大肠杆菌MG1655、铜绿假单胞菌PAO1、单增李斯特菌(Listeria-2W11)培养物用无菌生理盐水稀释至10

免疫磁珠捕获LM的敏感性检测：LB培养基培养过夜的Listeria-2W11，用无菌生理盐水10倍稀释至10

不同菌浓度(10

表4

人工污染牛奶中LM的检测：过夜培养的细菌Listeria-2W11，用无菌生理盐水稀释至10

通过向牛奶样品中添加LM，模拟受到LM污染的现场检测样品，检测免疫磁珠的实用性。结果表明，单增李斯特氏菌的检出数为10

表5

免疫磁珠的稳定性检测：过夜培养的Listeria-2W11，用无菌生理盐水10倍稀释菌体至10

表6

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 单核细胞增生李斯特菌P60单克隆抗体及免疫磁珠和用途

<130> HBI1420ZGYJ

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列（上游引物）

<400> 1

catatgtgga gccacccgca gttcgaaaag gcaatttcga gcctaaccta tc 52

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列（下游引物）

<400> 2

ctcgagagta gctgtgttag cagtttgt 28

<210> 3

<211> 702

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

catatgtgga gccacccgca gttcgaaaag gtagtcgaag ctggtgatac tctttggggt 60

atcgcacaaa gtaaagggac tactgttgac gcaattaaaa aagcaaacaa tttaacaaca 120

gataaaatcg taccaggtca aaaattacaa gtaaataatg aggttgctgc tgctgaaaaa 180

acagagaaat ctgttagcgc aacttggtta aacgtccgta gtggcgctgg tgttgataac 240

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