一种可控缓释的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微囊的制备方法及其应用

摘要

本发明提供一种可控缓释细胞因子的聚乳酸‑羟基乙酸共聚物微囊的制备方法。步骤包括：1)将PLGA溶于二氯甲烷制成溶液，水溶性细胞因子溶于无菌水中制成溶液；2)在双通道微量注射泵的A、B通道分别装载PLGA溶液和细胞因子溶液，并分别连接到同轴注射针头的外针和内针，设定A、B通道各自的注射速度；3)将同轴针头插入聚乙烯醇溶液，注射结束后过滤，获得包封细胞因子的PLGA微囊。本方法制备得到的PLGA微囊具备平均百微米以上的直径，粒径分布窄，表面适合细胞粘附生长，且每一颗都包含一个圆形的规则内腔。通过制备工艺的调整，可以控制微囊囊壁的厚度，从而控制缓释的速率和持续时间。该PLGA微囊可用于制备引导牙槽骨再生的药物。

说明书

技术领域

本发明主要涉及引导骨再生的组织工程领域和药物缓释领域，特别涉及一种具备可控缓释能力的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)微囊的制备方法及其应用。

背景技术

PLGA微球最初的开发是为了用于载药及缓释。得益于PLGA降解速度的可控性，理论上制备成的微球的释药速率和时间也是可控的。除外载药缓释，近年来研究者们还发现PLGA微球的规则外形使其尚且具备成为一种三维细胞培养支架的潜力，若将一定量的微球堆叠并固定成整块，还可形成一种特殊的多孔且孔隙高度连通的细胞支架，并具备一定的抗压强度，有较好的空间维持能力，非常适合引导牙槽骨再生修复。在所有微球中，一类具备“壳-芯”结构的微球，或微囊，因具备更高的药物包封效率，更可控的缓释动力学，甚至可以分别精确控制壳层、芯层的尺寸、结构等优点，越来越受到缓释给药领域的重视，得到了飞速的发展。目前可检索到的PLGA微囊制备方法包括乳液挥发法、微流控法、相分离法、喷雾干燥法、超临界流体法和膜乳化法等。

所有微囊制备方法中乳液挥发法以其成本较低，技术简单，可快速批量生产等特点应用最多。但是传统的乳液挥发法属于批量成型技术，所制备的微囊粒径分布宽，药物包封率低，释放曲线难以调控。虽然也可通过膜乳化法在一定压力下使乳液液滴通过固定直径的孔膜从而得到粒径均匀的微囊，但是该方法需要特殊设备提供较大的压力，购买昂贵的进口孔膜。膜孔的堵塞清理也是一大难题。

事实上传统乳液挥发法是针对微纳米级别的微囊而开发的，利于制备较小粒径，如小于10μm，甚至是小于1μm的微囊，且粒径越小，微囊的形貌结构越均一。但是这种级别粒径的微囊若用于引导骨再生，堆叠后形成的块状支架过于致密，内部孔隙过小，细胞传导性不良，并不利于成骨。若利用该方法法制备百微米以上粒径的微囊，则粒径分布极不均匀，也难以形成稳定的壳-芯结构。因此亟需开发一种能够将粒径均一分布在百微米，且适宜工业化批量生产的PLGA微囊制备方法，以满足临床引导骨再生中的需求。

发明内容

发明目的：本发明的目的是克服传统乳液挥发法制备PLGA微囊技术的不足，开发一种新的利用双通道同轴注射成型的PLGA微囊的制备方法，使用该方法可稳定制备粒径、结构可控的微囊，本发明中所制得的微囊平均粒径大于100μm，囊腔结构稳定，且微囊的囊壁厚度可控，使其兼具细胞支架和可控缓释的优势。本发明利用同轴双通道注射技术制备PLGA壳-芯微囊，为克服上述技术门槛，利用流动液体剪切力形成液滴的方法，仅用常见易获取的双通道微量注射泵和同轴注射针搭建了稳定而高效的微囊制备装置，将外水相溶液转移至收集装置中并持续搅拌形成恒速涡流，并直接将同轴注射针头置于涡流中，在无需附加“截断”设备的情况下，调节收集装置中涡流的速度，形成适当的剪切力使同轴注射针中的连续流体在针头处形成稳定的液滴，通过双通道注射速度、同轴注射针内外直径和收集装置中涡流速度的调控，最终得到形貌结构高度可控的PLGA壳-芯微囊。

本发明所述PLGA是指：聚乳酸-羟基乙酸共聚物；

本发明所述PVA是指：聚乙烯醇。

本发明技术方案如下：

本发明的第一个目的是提供一种可控缓释的羟基乙酸共聚物微囊的制备方法，其制备步骤包括：

1)聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于二氯甲烷配制成聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液，被包裹体溶于无菌蒸馏水中制成被包裹体水溶液，将两种溶液分别置于相应的注射器中；

2)双通道微量注射泵包括A通道和B通道，所述A通道为外通道，B通道为内通道，将装载有聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液的注射器安装到双通道微量注射泵的A通道，装载有被包裹体水溶液的注射器安装到双通道微量注射泵的B通道；将同轴注射针头的外针连接A通道，内针连接B通道；

3)聚乙烯醇溶于去离子水制备成聚乙烯醇溶液，将同轴注射针头置于聚乙烯醇溶液液面以下；

4)保持聚乙烯醇溶液处于搅拌状态，调整A、B通道各自注射速度，启动双通道微量注射泵；

5)注射结束后恒温持续搅拌，过滤得到载药聚乳酸-羟基乙酸共聚物微囊，用无菌蒸馏水漂洗、过滤，最后将微囊冷冻干燥。

进一步的，所述步骤1)中的聚乳酸-羟基乙酸共聚物中乳酸/羟基乙酸比例为75:25，分子量为1.2kDa；所述被包裹体选自水溶性细胞因子、水溶性药物、水溶性蛋白、非水溶性药物的悬浊液。

进一步的，所述步骤1)中聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液的浓度为0.05g/mL～0.2g/mL，优选的，所述步骤1)中聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液的浓度为0.1g/mL。

进一步的，所述步骤2)中的注射器为20mL或50mL。

进一步的，所述步骤2)中的同轴针头的外针直径为0.5-1.0mm，内针直径为0.1-0.3mm。

进一步的，所述步骤3)中的聚乙烯醇溶液的浓度为1-2g/100mL。

进一步的，所述步骤3)中聚乙烯醇溶液的温度为4-39℃。

进一步的，所述步骤4)中搅拌转速为150-200rpm；A通道的注射速度为300-600mL/h，B通道的注射速度为30-100mL/h。

进一步的，所述步骤5)中搅拌转速为200-300rpm，搅拌时的恒定温度为20-39℃，搅拌时间8-12h。

本发明的第二个目的是提供一种可控缓释的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微囊，所述可控缓释的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微囊是采用前述的可控缓释的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微囊的制备方法制备得到的。

本发明的第三个目的是提供前述的可控缓释的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微囊的制备方法或前述一种可控缓释的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微囊在制备引导骨再生的药物中的应用，优选的，在制备引导牙槽骨再生的药物中的应用。

所述可控缓释的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微囊包裹被包裹体，所述被包裹体选自与引导牙槽骨再生的水溶性细胞因子、水溶性药物、水溶性蛋白、非水溶性药物的悬浊液，在某个特定的实施例中，所述被包裹体为骨形态发生蛋白2(BMP-2)。

本发明中提出一种新的双通道微量同轴注射成型的PLGA微囊制备方法。同轴针头的外针连接装载PLGA溶液的A通道，内针连接装载被包裹体的B通道，在微量注射泵对双通道各自注射速度的精确控制下，在收集装置内以一定速度旋转流动的水相中得到了一种新型的具备“壳-芯”结构的PLGA微囊，这使得每一颗成品都具有单个规则内腔，与传统的乳液挥发法工艺相比，新方法的乳液液滴为单颗依次形成，无论如何改变各项工艺参数，都能对每一颗微囊造成同样的影响，得到均一性极高的量产物。通过工艺参数的调整，理论上可精确控制微囊的外径和内径，也即囊壁的厚度，进而为控制药物或因子的释放速度和时间提供了必要条件。并且替换B通道内的药物或因子，也可方便地使微囊包封不同的内容物。

有益效果

本发明相较现有其他技术而言，具有以下优点：

(1)本发明提供的双通道同轴注射成型的PLGA微囊制备方法所制得的微囊粒径可达100-200μm，且粒径分布集中度高，几乎所有微囊都具备单一规则的囊腔，微囊的壁厚度可控，由此可以控制微囊内容物释出的时间。

(2)本发明的可变工艺参数包括PLGA溶液浓度、双通道各自的注射速度、收集装置内的液体流速等，通过不同环节参数的调整，可以控制最终微囊的粒径，囊壁的厚度，且能对每一颗微囊造成同样的影响，得到均一性极高的量产物。

(3)改变B通道内的溶质，即可方便的制备出包封不同药物或其他被包裹体的微囊。

(4)本发明的微囊制备方法属于精确乳液挥发成型技术，与该类技术大多需要专业精密设备，搭建复杂系统不同，本发明结合了同轴注射和涡流剪切的方法，利用常见易获取的设备就可稳定制备壳-芯结构的微囊，在保证产品品质的同时，显著降低了生产成本。

(5)将本发明中制备的PLGA载药微囊堆叠，就能得到一种能可控缓释多种药物或其他被包裹体的细胞支架，且该支架孔径较大，孔隙高度连通，具备良好的细胞相容性和细胞传导性，具备较好的引导牙槽骨再生的应用前景。

附图说明

图1为传统乳液挥发法制备的PLGA微囊扫描电镜图。

图2为实施例2制备的PLGA微囊在正置荧光显微镜下的图像。

图3为实施例3制备的PLGA微囊经粒度分析仪测量的粒径分布。

图4为实施例3制备的PLGA微囊在正置荧光显微镜下的图像。

图5为包封BMP-2的PLGA微囊对成骨细胞的趋化作用。

图6为本发明所制备的厚壁、薄壁型微囊的缓释曲线。

图7为PLGA微囊的细胞相容性检测。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，其具体实施方式如下：

实施例1传统乳液挥发法制备的PLGA微囊

1g PLGA(乳酸/羟基乙酸比例为75:25，分子量为1.2kDa)溶于10mL二氯甲烷配置成PLGA溶液(0.1g/mL)，取5mL PLGA溶液，与200μL去离子水一起加入烧杯中，1500rpm磁力搅拌2分钟形成乳液。聚乙烯醇(PVA)配制成1％质量分数的溶液，取10mL加入前面所得乳液中并以1500rpm搅拌2-3分钟，再加入400mL 0.1％的PVA溶液以250rpm搅拌8小时，过滤收集PLGA微囊并冷冻干燥。

图1所示为按实施例1制备所得的PLGA微囊在扫描电镜的形貌。可见镜下微囊粒径分布较宽，从数十微米至两百微米不等。

实施例2

1g PLGA(乳酸/羟基乙酸比例为75:25，分子量为1.2kDa)溶于10mL二氯甲烷配置成PLGA溶液置于50mL注射器，被包裹体为荧光素钠，将荧光素钠溶于去离子水制成100μg/mL的溶液。双通道微量注射泵包括A通道和B通道，所述A通道为外通道，B通道为内通道，将装有PLGA溶液的50mL注射器安装到微量注射泵的A通道，装有荧光素钠溶液的20mL注射器安装到微量注射泵的B通道，调整A通道注射速度为550mL/h，B通道注射速度为70mL/h，分别连接同轴针头的外针和内针入口，同轴针头的外针直径为0.85mm，内针直径为0.26mm。

8g PVA溶于400mL去离子水制备成2g/100mL的PVA溶液置于500mL烧杯中，将同轴针头置于PVA溶液液面以下，调整磁力搅拌器转速为200rpm，注射器排气后开始注射，注射结束后将针头从PVA溶液中取出。磁力搅拌器控制温度在39℃搅拌12h后，将烧杯内微囊过滤、漂洗，将所得微囊在正置荧光显微镜下观察，并用粒度分析仪分析粒径分布。

图2所示为按实施例2制备的PLGA微囊在正置荧光显微镜下的图像，微囊内包封的荧光素纳在荧光显微镜下受激发产生荧光，显示了清晰的囊腔和囊壁，经图像分析软件测量实施例1中制备的PLGA微囊囊壁厚度平均约为25μm，几乎所有微囊都具备单一规则的圆形囊腔。

图3按实施例2制备的微囊经粒径分析仪测量所得粒径分布，可见微囊粒径基本集中于100-200μm之间，平均为170μm。

实施例3

1g PLGA(乳酸/羟基乙酸比例为75:25，分子量为1.2kDa)溶于10mL二氯甲烷配置成PLGA溶液置于50mL注射器，被包裹体为荧光素钠，将荧光素钠溶于去离子水制成100μg/mL的溶液。双通道微量注射泵包括A通道和B通道，所述A通道为外通道，B通道为内通道，将装有PLGA溶液的50mL注射器安装到微量注射泵的A通道，装有荧光素钠溶液的20mL注射器安装到微量注射泵的B通道，调整A通道注射速度为580mL/h，B通道注射速度为35mL/h，分别连接同轴针头的外针和内针入口，同轴针头的外针直径为0.85mm，内针直径为0.16mm。

8g PVA溶于400mL去离子水制备成2g/100mL的PVA溶液置于500mL烧杯中，将同轴针头置于PVA溶液液面以下，调整磁力搅拌器转速为200rpm，注射器排气后开始注射，注射结束后将针头从PVA溶液中取出。磁力搅拌器控制温度在20℃搅拌8h后，将烧杯内微囊过滤、漂洗，将所得微囊在正置荧光显微镜下观察。

图4所示为按实施例2制备的PLGA微囊在正置荧光显微镜下的图像，微囊内包封的荧光素纳在荧光显微镜下受激发产生荧光，显示了清晰的囊腔和囊壁，经图像分析软件测量实施例2中制备的PLGA微囊囊壁厚度平均约为35μm，几乎所有微囊都具备单一规则的圆形囊腔。

实施例4本发明微囊对成骨细胞驱化效果验证试验

1g PLGA(乳酸/羟基乙酸比例为75:25，分子量为1.2kDa)溶于10mL二氯甲烷配置成PLGA溶液置于50mL注射器，被包裹体为大鼠BMP-2，大鼠BMP-2溶于去离子水配制成500ng/mL的溶液。双通道微量注射泵包括A通道和B通道，所述A通道为外通道，B通道为内通道，将装有PLGA溶液的50mL注射器安装到微量注射泵的A通道，装有BMP-2溶液的20mL注射器安装到微量注射泵的B通道，调整A通道注射速度为550mL/h，B通道注射速度为70mL/h，分别连接同轴针头的外针和内针入口，同轴针头的外针直径为0.85mm，内针直径为0.26mm。

8g PVA溶于400mL去离子水制备成2g/100mL的PVA溶液置于500mL烧杯中，将同轴针头置于PVA溶液液面以下，调整磁力搅拌器转速为200rpm，注射器排气后开始注射，注射结束后将针头从PVA溶液中取出。磁力搅拌器控制温度在39℃搅拌10h后，将烧杯内微囊过滤、漂洗，冷冻干燥。

取20μL体积的包封BMP-2的PLGA微囊加700μLα-MEM基础培养基(Gibco，美国)置于Transwell小室的下室，上室加200μL基础培养基重悬后的小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1细胞，接种密度为5×10

图5所示为包封BMP-2的PLGA微囊对成骨细胞的趋化作用。在将该实施例中制备的微囊置于transwell小室的下室，与下室未加微囊的对照组比较对各自上室的成骨细胞的趋化作用。a、b为transwell小室下室的细胞染色大体图像，c、d为显微镜下的细胞图像，a、c为微囊组，b、d为对照组，结果显示：因为微囊持续释放BMP-2，下室的因子浓度较高，仅在24小时内就可以观察到更多的成骨细胞从上室迁移至下室(a，c)，而对照组迁移至下室的细胞数量明显较少(b、d)。

实施例5本发明微囊缓释效果验证试验

组1：1g PLGA(乳酸/羟基乙酸比例为75:25，分子量为1.2kDa)溶于10mL二氯甲烷配置成PLGA溶液置于50mL注射器，被包裹体为牛血清蛋白(BSA)，将BSA溶于去离子水制成100μg/mL的溶液。双通道微量注射泵包括A通道和B通道，所述A通道为外通道，B通道为内通道，将装有PLGA溶液的50mL注射器安装到微量注射泵的A通道，装有BSA溶液的20mL注射器安装到微量注射泵的B通道，调整A通道注射速度为550mL/h，B通道注射速度为70mL/h，分别连接同轴针头的外针和内针入口，同轴针头的外针直径为0.85mm，内针直径为0.26mm。

8g PVA溶于400mL去离子水制备成2g/100mL的PVA溶液置于500mL烧杯中，将同轴针头置于PVA溶液液面以下，调整磁力搅拌器转速为200rpm，注射器排气后开始注射，注射结束后将针头从PVA溶液中取出。磁力搅拌器控制温度在39℃搅拌12h后，将烧杯内微囊过滤、漂洗，得到薄壁PLGA微囊。

组2：1g(乳酸/羟基乙酸比例为75:25，分子量为1.2kDa)PLGA溶于10mL二氯甲烷配置成PLGA溶液置于50mL注射器，被包裹体为牛血清蛋白(BSA)，将BSA溶于去离子水配制成500ng/mL的溶液。双通道微量注射泵包括A通道和B通道，所述A通道为外通道，B通道为内通道，将装有PLGA溶液的50mL注射器安装到微量注射泵的A通道，装有BSA溶液的20mL注射器安装到微量注射泵的B通道，调整A通道注射速度为580mL/h，B通道注射速度为35mL/h，分别连接同轴针头的外针和内针入口，同轴针头的外针直径为0.85mm，内针直径为0.16mm。

8g PVA溶于400mL去离子水制备成2g/100mL的PVA溶液置于500mL烧杯中，将同轴针头置于PVA溶液液面以下，调整磁力搅拌器转速为200rpm，注射器排气后开始注射，注射结束后将针头从PVA溶液中取出。磁力搅拌器控制温度在39℃搅拌12h后，将烧杯内微囊过滤、漂洗，得到厚壁PLGA微囊。

将组1和组2两种厚度载有BSA的PLGA微囊冷冻干燥后各取100μL于1.5mL离心管，每种厚度设3个离心管，每个离心管中加入150μL的PBS(PH＝7.4)，将离心管置于150rpm/分钟的37℃恒温摇床，分别在第1天，5天，10天，15天，20天，25天取出离心管，用紫外分光光度计测量上清中BSA的浓度并记录，同时更换等量PBS溶液。

图6为两种囊壁厚度的PLGA微囊的体外药物缓释曲线，可见本发明制得的不同囊壁厚度的微囊可稳定释放药物持续近一个月的时间，且不同的囊壁厚度的微囊药物释放的速度不一致，提示可通过控制囊壁的厚度控制药物缓释。

实施例6本发明微囊细胞相容性验证试验

组1：1g PLGA(乳酸/羟基乙酸比例为75:25，分子量为1.2kDa)溶于10mL二氯甲烷配置成PLGA溶液置于50mL注射器，被包裹体为牛血清蛋白，将牛血清蛋白(BSA)溶于去离子水制成100μg/mL的溶液。双通道微量注射泵包括A通道和B通道，所述A通道为外通道，B通道为内通道，将装有PLGA溶液的50mL注射器安装到微量注射泵的A通道，装有BSA溶液的20mL注射器安装到微量注射泵的B通道，调整A通道注射速度为550mL/h，B通道注射速度为70mL/h，分别连接同轴针头的外针和内针入口，同轴针头的外针直径为0.85mm，内针直径为0.26mm。

8g PVA溶于400mL去离子水制备成2g/100mL的PVA溶液置于500mL烧杯中，将同轴针头置于PVA溶液液面以下，调整磁力搅拌器转速为200rpm，注射器排气后开始注射，注射结束后将针头从PVA溶液中取出。磁力搅拌器控制温度在39℃搅拌12h后，将烧杯内微囊过滤、漂洗，得到薄壁PLGA微囊。

组2：1g PLGA(乳酸/羟基乙酸比例为75:25，分子量为1.2kDa)溶于10mL二氯甲烷配置成PLGA溶液置于50mL注射器，被包裹体为牛血清蛋白，将牛血清蛋白(BSA)溶于去离子水配制成500ng/mL的溶液。双通道微量注射泵包括A通道和B通道，所述A通道为外通道，B通道为内通道，将装有PLGA溶液的50mL注射器安装到微量注射泵的A通道，装有BSA溶液的20mL注射器安装到微量注射泵的B通道，调整A通道注射速度为580mL/h，B通道注射速度为35mL/h，分别连接同轴针头的外针和内针入口，同轴针头的外针直径为0.85mm，内针直径为0.16mm。

8g PVA溶于400mL去离子水制备成2g/100mL的PVA溶液置于500mL烧杯中，将同轴针头置于PVA溶液液面以下，调整磁力搅拌器转速为200rpm，注射器排气后开始注射，注射结束后将针头从PVA溶液中取出。磁力搅拌器控制温度在39℃搅拌12h后，将烧杯内微囊过滤、漂洗，得到厚壁PLGA微囊。

将组1和组2不同囊壁厚度的PLGA微囊各取20μL混合后在75％乙醇中浸泡1h，去除乙醇，用PBS冲洗三遍，置于6孔板中作为实验组，不加微囊组为空白组。将MC3T3-E1细胞按1×10

图7为在PLGA微囊表面接种MC3T3-E1细胞后7天的活死细胞染色图片。可见细胞在微囊表面粘附生长良好，与空白对照组细胞活力无明显差异，具有优异的生物相容性。