一种法国梧桐花粉过敏原及其应用

摘要

本发明公开了一种法国梧桐花粉的新过敏原及其应用。本发明所述的一种法国梧桐花粉的新过敏原，其为从法国梧桐花粉中分离纯化获得的烯醇化酶，本发明还通过基因克隆获得该过敏原的编码基因如SEQ ID NO：1所示，该过敏原由445个氨基酸组成如SEQ ID NO：2所示。本发明所公开的过敏原是从法国梧桐花粉中新发现的一种新过敏原，可用于制备梧桐花粉过敏症的诊断和检测试剂盒，或者用于个体化脱敏疫苗的开发和应用。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，特别涉及一种法国梧桐花粉中的新过敏原及其应用。

背景技术

过敏性疾病是一种临床常见病，包括如过敏性鼻炎、过敏性哮喘、过敏性皮炎、荨麻疹等。暴露于过敏原是过敏性疾病发生发展的一个重要原因，其中花粉便是户外过敏原最广泛和最丰富的来源之一。

梧桐因其耐寒、抗旱等特性被作为城市观赏树种广泛种植于西欧、新西兰、澳大利亚、北美的很多城市，近年来梧桐花粉浓度显著增加，是造成春季花粉过敏的重要原因之一。欧洲过敏和临床免疫学会（EAACI）已确认梧桐花粉是引起呼吸道症状的重要过敏原，并已将其作为欧洲所有疑似变应性鼻炎患者花粉过敏原调查必不可少的措施。尽管近年来梧桐花粉在过敏性疾病中的重要性有所增加，但关于该花粉中过敏原研究报道却很少。到目前为止，仅有4种梧桐花粉过敏原（Pla a1、Pla a2、Pla a3、Plaaprofilin）得到了鉴定。然而，先前对梧桐花粉粗提的血清杂交印记实验暗示了该花粉中仍然存在多种未知的过敏原蛋白存在，但一直都未得到充分的研究。这不仅影响梧桐花粉过敏的免疫发病机制探究，还阻碍基于分子精准化和个体化诊断、治疗方法的发展及应用。

基于以上问题，进一步对梧桐花粉中过敏原的鉴定和致敏性研究是必要的，这不仅能够丰富其中引起过敏症的分子信息，还可基于过敏原分子开发用于诊断、预防和治疗梧桐花粉过敏症试剂盒或脱敏疫苗。然而，花粉中蛋白种类繁多、成分复杂，不仅含有过敏原蛋白，还存在非致敏性蛋白以及非蛋白类成分，对从中鉴定真正的过敏原成分产生极大的阻碍。同时，明确编码过敏原的基因序列和氨基酸序列也是另一难题，传统方法依赖于构建cDNA文库并结合基因特异性引物进行反复扩增克隆和测序，其研究效率较低并且应用受限。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明所要解决的技术问题是提供了一种法国梧桐花粉的新过敏原烯醇化酶以及使用其在过敏性疾病中的应用。

本发明还要解决的技术问题包括提供了法国梧桐花粉新过敏原烯醇化酶的纯化制备、内部氨基酸肽段测定、核酸或基因序列的克隆，其编码所述的法国梧桐花粉的过敏原、其致敏性的研究应用。

本发明还要解决的技术问题是提供了表达盒、重组载体、重组蛋白、重组细胞或重组菌。

本发明还要解决的技术问题是通了法国梧桐花粉的过敏原、所述的核酸或基因、所述的表达盒、重组载体、重组蛋白或重组细胞在用于制备诊断梧桐花粉过敏性疾病的试剂盒或预防或治疗梧桐花粉过敏性疾病的药物中的应用。

本发明最后要解决的技术问题是提供了一种用于预防或治疗梧桐花粉过敏症的药物或疫苗或用于过敏原诊断的试剂盒。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种法国梧桐花粉的过敏原，所述过敏原的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

其中，所述法国梧桐花粉的过敏原为过敏原烯醇化酶。

其中，所述过敏原包括9个内部特征肽段，所述9个内部特征肽段包括EALELR、DGGSDYLGK、KIPLYK、HIANLSGNK、NGGSHAGNK、MGVEVYHHLK、FKEENNDGSQK、RAGWGVMASHR和YNQLLR。

本发明还公开了所述的法国梧桐花粉的过敏原的纯化方法，包括以下步骤：

1）梧桐花粉提取总蛋白：首先将花粉与磷酸盐缓冲液混合，加入蛋白酶抑制剂孵育过夜，离心后收集上清，0.22μm膜过滤得到梧桐花粉提取物备用；

2）IgE结合成分的纯化；梧桐花粉提取物通过阴离子交换、凝胶过滤和阳离子交换的层析步骤分离即得。

具体地，首先将花粉粗提物以平衡的HiTrapDesalting层析柱进行溶液置换，收集的洗脱组分在与上述相同缓冲液平衡的HiTrap Q HP柱上吸附，吸附的蛋白用含有氯化钠的Tris–HCl溶液按梯度洗脱。其次，洗脱的组分通过SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝R250染色，将蛋白分布相似的部分合并后于Superdex G200分离，该柱用含有氯化钠的磷酸盐缓冲液平衡，洗脱，用SDS-PAGE对所得组分进行分析合并进行下一步的分离。合并的部分被进一步吸附到HiTrap S HP柱上，用含有氯化钠的2-吗啉乙磺酸进行洗脱，用SDS-PAGE电泳分析，最终纯化出梧桐花粉新过敏原烯醇化酶，该过敏原在SDS-PAGE上以单个蛋白带的形式在约48 kDa处显示。

本发明内容还包括核酸或基因，其编码所述的法国梧桐花粉的过敏原。

所述的核酸或基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，还包括与SEQ ID NO：1具有简并性质的序列，这些核苷酸序列编码的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO：2。

本发明内容还包括表达盒、重组载体、重组蛋白、重组细胞或重组菌，其包含所述的核酸或基因。

本发明内容还包括所述的法国梧桐花粉的过敏原、所述的核酸或基因、所述的表达盒、重组载体、重组蛋白或重组细胞在用于制备诊断梧桐花粉过敏性疾病的试剂盒或预防或治疗梧桐花粉过敏性疾病的药物中的应用。

本发明内容还包括所述的法国梧桐花粉的过敏原、所述的核酸或基因、所述的表达盒、重组载体、重组蛋白或重组细胞在制备检测患者血清中的梧桐花粉烯醇化酶特异性IgE含量的药物或试剂中的应用。

本发明内容还包括所述的法国梧桐花粉的过敏原、所述的核酸或基因、所述的表达盒、重组载体、重组蛋白或重组细胞在制备检测患者嗜碱性粒细胞被激发的程度的药物或或试剂中的应用。

本发明内容还包括一种用于预防或治疗梧桐花粉过敏症的药物，所述药物为单方或复方制剂，其包括所述的过敏原或所述的核酸或基因。

本发明内容还包括一种预防桐花粉过敏症的疫苗，所述疫苗包括所述的过敏原或所述的核酸或基因。

本发明内容还包括一种用于过敏原诊断的试剂盒，所述试剂盒包括所述的过敏原或所述的核酸或基因。

其中，所述试剂盒还包括连接或吸附有该过敏原的固相载体，可以用于检测患者血清中的梧桐花粉烯醇化酶特异性IgE含量。

其中，所述试剂盒还可以用于检测患者嗜碱性粒细胞被激发的程度。

有益效果：对于过敏症患者，一个重要的诊断手段是检查出引起过敏的过敏原，通过针对性的脱敏治疗可有效的控制过敏症。本发明提供了一种新的法国梧桐花粉中的新过敏原烯醇化酶，其为梧桐花粉中发现的第5种过敏原。该过敏原可被用于制备梧桐花粉过敏原检测试剂盒，或者用于个体化脱敏疫苗的开发和应用。

附图说明

图1A是在HiTrap Q HP阴离子交换柱上对梧桐花粉提取物的洗脱图谱，用箭头标记的部分被合并起来用于进一步纯化的，黑色框中是含有梧桐花粉烯醇化酶的部分。

图1B是合并后在Superdex G200色谱柱上的洗脱图，其中7-9部分（黑框标出）是含有梧桐花粉烯醇化酶的部分。

图1C是合并后的组分在1ml HiTrap SP HP柱上纯化的图谱，黑色框标记的部分为纯化得到的梧桐花粉烯醇化酶蛋白。

图2是通过高分辨率串联质谱得到的梧桐花粉烯醇化酶内部肽段序列，共9个。

图3是编码梧桐花粉烯醇化酶的核苷酸序列及其氨基酸序列，下划线部分是质谱鉴定到其中的肽段。

图4A是免疫印迹法检测梧桐花粉过敏患者血清中烯醇化酶的特异性IgE水平，37例梧桐花粉过敏患者的血清中，12例显示含有该过敏原特异性的IgE。

图4B是竞争性ELISA方法测定梧桐花粉烯醇化酶特异性IgE在过敏患者血清梧桐花粉IgE中的占比。

图5是通过嗜碱性粒细胞激法测定梧桐花粉烯醇化酶对5例患者全血样本中嗜碱性粒细胞的激发结果。

具体实施方式

以下结合附图做进一步的说明。

实施例1Pla a enolase蛋白的纯化

称取8.0 g梧桐花粉提取总蛋白：首先将花粉与60 mL 0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)混合，加入终浓度为1 mM 蛋白酶抑制剂（PMSF）在4℃颠倒孵育过夜，12000×g离心后收集上清，0.22μm膜过滤备用。

梧桐花粉中IgE结合成分的纯化：梧桐花粉提取物在ÄKTA-go系统（GEHealthcare, Uppsala, Sweden）上通过阴离子交换、凝胶过滤和阳离子交换的层析步骤分离。具体地，先将花粉粗提物以0.02 M Tris-HCl、pH 8.4平衡的HiTrap脱盐柱进行脱盐，收集的组分在与上述相同缓冲液平衡的HiTrap Q HP柱上吸附（Uppsala，Sweden），吸附的蛋白用含有1M 氯化钠的0.02 M Tris–HCl溶液按梯度0%到100% ，流速5mL/min，时间40min洗脱，参见图1A，黑色框中是含有梧桐花粉烯醇化酶的部分。洗脱的组分通过SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝R250染色，将蛋白分布相似的部分合并后于Superdex G200分离，该柱用含有150 mM氯化钠的50 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.15）平衡，以0.5 mL/min的流速洗脱，用SDS-PAGE对分离结果进行分析，对蛋白分布相同的部分进行合并用于下一步的分离，参见图1B，其中7-9合并部分（黑框标出）是含有Pla a enolase的部分。合并的部分被进一步吸附到1mL HiTrap S HP层析柱（Uppsala, Sweden），用50 mM2-吗啉乙磺酸，pH5.98，流速1mL/min进行洗脱，参见图1C，黑色框标记的部分为纯化得到的梧桐花粉烯醇化酶蛋白，通过13%的SDS-PAGE电泳分析显示该蛋白的电泳迁移为位置约在48kDa。

实施例2 梧桐花粉烯醇化酶的内部肽段鉴定

首先将实施例1中分离纯化获得的蛋白，经SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝R250染色后，将其从凝胶中切取，用胰蛋白酶消化后进行高分辨率质谱鉴定分析，得到9个内部肽段序列（参见图2），其对氨基酸全长的覆盖率为17.3%（参见图3）。

实施例3梧桐花粉烯醇化酶核苷酸序列的克隆

我们通过高分辨率串联质谱获得的肽段与高通量花粉转录组测序结果进行匹配，得到编码桐花粉烯醇化酶的理论基因序列，并通过PCR扩增该基因结合T-A克隆和Sanger测序得到最终的核苷酸序列信息。具体来说，首先利用植物RNA提取试剂盒MiniBEST PlantRNA Extraction Kit（宝日医生物技术有限公司，大连，中国）梧桐花粉总RNA，使用PrimeScript RT Master Mix（宝日医生物技术有限公司，大连，中国）逆转录得到cDNA产物。根据梧桐花粉烯醇化酶的理论基因序列，按照TakaraExTaq扩增酶的操作手册（宝日医生物技术有限公司，大连，中国），以25μL的体系进行PCR扩增该序列：ExTaq酶（0.125 μl）、10×ExTaqbuffer（2.5μl）、dNTP混合物（2μl）、梧桐花粉cDNA产物（1μl）、上游引物和下游引物混合物（1μl）、灭菌蒸馏水补充至25μl。上游引物为5 ' -CGAGAAAAATCGGAGAGAACTAC-3'，下游引物为5 ' -CTTCTTGCTAACCGTAATAAGC-3 '。PCR条件为98℃预变形/ 5s(1个循环)、98℃变性/ 10 s、55℃退火/30s和72℃延伸/ 1 min(30个循环)、72℃再延伸/ 10min(1个循环)。将PCR扩增产物回收、纯化并连接到pCE2 TA/Blunt-zero质粒载体（诺唯赞生物科技股份有限公司，南京，中国）（货号：C601-01），转化至JM109感受态细胞。在含有100µg/ mL卡那霉素的Luria-Bertani (LB)平板上筛选阳性克隆，并通过DNA测序确认，该基因全长1338bp，编码445个氨基酸，理论分子量为47kDa。其核苷酸序列参见SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列参见SEQ ID NO：2所示。

利用ClonExpress II One Step Cloning Kit（诺唯赞生物科技股份有限公司，南京，中国）并按照操作说明，将梧桐花粉烯醇化酶的编码区核苷酸序列克隆连接至pET28a+质粒的NcoI和XhoI位点之间。构建好的重组过敏原质粒经热激转化至BL21（DE3）宿主菌（诺唯赞生物科技股份有限公司，南京，中国）进行平板克隆，挑取单克隆菌落在液体培养基中37℃培养，加入终浓度1mM的IPTG诱导剂（宝日医生物技术有限公司，大连，中国）并继续在37℃培养6h。随后离心收集菌体，经70%功率超声破碎仪裂解菌体，并将裂解产物经HiTrap层析柱纯化得到梧桐花粉烯醇化酶蛋白。

实施例4梧桐花粉烯醇化酶蛋白的免疫印记

将实施例1纯化的梧桐花粉烯醇化酶蛋白经过SDS-PAGE电泳后转移到PVDF膜上，用5%的牛奶在PBS中封闭2h，三次PBST洗涤后，与经ImmunoCAP测定后明确对梧桐花粉过敏的患者血清（样本来源于南京医科大学第一附属医院）稀释10倍后在4℃共同孵育过夜。次日，洗涤后将膜与1:5000稀释的抗人IgE-辣根过氧化物酶结合物室温孵育。洗涤3次后，利用天能5200多功能成像系统进行特异性检测。检测结果参见图4A，37例梧桐过敏患者的血清中，12例显示IgE对梧桐花粉烯醇化酶呈阳性IgE结合反应，第38号血清样本来源于非梧桐花粉过敏者作为阴性参照。

实施例5竞争抑制ELISA试验

本实施例的目的是测定梧桐花粉烯醇化酶蛋白对梧桐花粉粗提物结合梧桐过敏患者血清IgE的抑制效率。以10μg/mL的梧桐花粉粗提物在PBS溶液中包被聚苯乙烯板，每孔100μL，4℃过夜。共10例对梧桐花粉烯醇化酶阳性反应的患者血清，每5例混合（图4B中的a图和b图分别为两组不同的混合血清池进行测定的结果），稀释后单独或与不同浓度的花粉粗提物（0.001、0.01、0.1、1、10μg/mL）和梧桐花粉烯醇化酶预孵育过夜备用。次日，37℃下用含1% BSA的PBST溶液封闭2 h，洗涤后每孔加入100 μL的预孵育血清，37℃孵育1h。洗涤后，加入1:2500稀释的抗人IgE -辣根过氧化物酶结合物37℃孵育1小时。洗涤后加入显色液13分钟后终止，酶标仪OD450检测。通过公式计算结果，参见图4B，结果表明梧桐花粉烯醇化酶蛋白对梧桐粗提物结合梧桐过敏患者血清IgE的最大抑制率在49.8%~64.7%。

实施例6 嗜碱性粒细胞激发试验

通过收集5例梧桐花粉过敏患者的全血，使用红细胞裂解液除去红细胞后，将梧桐花粉烯醇化酶加入处理后的细胞中，同时使用空白溶液作为阴性参照、anti-IgE作为阳性参照，将上述刺激体系置入37℃培养箱孵育30min。反应结束后，使用Alexa647-conjugatedanti-CD63 mAb（Biolegend, CA, USA）和PE-conjugated anti-CCR3 mAb（Biolegend, CA,USA）与刺激后的细胞冰上共孵育20min。洗涤后，经流式细胞仪圈定CCR3阳性细胞群并分析其中细胞表面CD63的表达情况。结果表明（图5）：与空白溶液组相比，梧桐花粉烯醇化酶在10μg/ml浓度时，可引起1.8倍至12.7倍的CCR3和CD63阳性细胞数量增加。

实施例7试剂盒及其应用

过敏患者血清中梧桐花粉过敏原烯醇化酶的特异性IgE检测：该试剂盒包含实施例1纯化的梧桐花粉烯醇化酶蛋白以及连接有该过敏原的固相载体，该固相载体可为NC膜、PVDF膜、聚苯乙烯板、蛋白芯片等，还可以包含被酶标记的抗IgE抗体以及成为该酶底物的显色底物或发光底物，如实施例4、实施例5中所描述。另外，也可以使用被荧光标记的抗IgE抗体。本发明的诊断试剂盒还可以与关于用于诊断的步骤的说明书、包含该说明的方法包一起提供。

过敏患者嗜碱性粒细胞活化检测：

已知在被过敏原刺激而活化后的嗜碱性粒细胞中，其表面CD63的表达增强（Hoffmann HJ. et al.，Allergy.，70：1393-405，2015）。本发明的诊断试剂盒可以在上述提供用于诊断过敏症的方法中应用。本发明的诊断试剂盒除了包含梧桐花粉过敏原烯醇化酶，还可以包含不同荧光标记的抗CD63抗体用于检测嗜碱性粒细胞的活化情况，还可以包含与标记抗CD63抗体所用荧光不同的其它荧光标记的抗CCR3抗体用于在流式细胞术中圈定嗜碱性粒细胞。根据CCR3和CD63双阳性细胞群中细胞数占比分析嗜碱性粒细胞的活化结果，如实施例6所描述。另外，也可使用不同荧光标记的抗HLA-DR抗体和抗CD123抗体来替代抗CCR3抗体用于圈定嗜碱性粒细胞群，也可使用荧光标记的抗CD203c抗体配合抗CD63抗体或单独应用以分析嗜碱性粒细胞活化状态。本发明的诊断试剂盒还可以与关于用于诊断的步骤的说明书、包含该说明的方法一起提供。

序列表

<110> 江苏省肿瘤医院、江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院）

<120> 一种法国梧桐花粉过敏原及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1401

<212> DNA

<213> 梧桐花粉过敏原烯醇化酶(Pla a enolase)

<400> 1

cgagaaaaat cggagagaac tacttcgatc gaacaaaaaa tggcgacgat caaggccgtt 60

aaagctaggc agatcttcga cagccgtgga aaccctaccg ttgaagtgga tgttactatt 120

tccgatggaa ccctagctag ggctgctgtt ccgagcggtg cttcgactgg tatctacgaa 180

gctctggaat taagagatgg aggatcggac taccttggga agggtgtact taaggctgta 240

gagaatgtca atgcaatcat tggacccgct ctgattggaa aggatccaac tgagcagaca 300

aagattgaca acttcatggt acaagagcta gatggaacag ttaatgagtg gggttggtgc 360

aaacagaagc ttggtgcaaa tgctatattg gcagtatcac ttgccatctg taaggcagga 420

gctagtgtga aaaagatccc cctttataag catatcgcca atctttctgg gaacaaaacc 480

ctagtgttgc cggtccctgc gttcaatgtc atcaatggag gttcacatgc aggcaataaa 540

ctagcgatgc aggagtttat gattcttcct gttggggcga cttccttcaa ggaagcaatg 600

aagatgggtg tagaagtata tcatcactta aaggctgtga ttaagaaaaa atatggccaa 660

gatgccacta atgttggtga tgaaggtggt tttgccccta acattcagga aaacaaagag 720

ggtcttgaac tgctgaagac cgccatagca aaagctggat acactggaaa agtggtgatt 780

gggatggatg tcgcagcgtc agagttctat gataacaagg acaagactta tgatttgaat 840

tttaaggagg agaacaatga tgggtcacag aaaatatcag gagatagttt gaagaatgtc 900

tacaagtcct ttgtgactga ttatccaatc gtatccatag aggatccatt tgatcaggat 960

gattgggagc actatgccaa gttgacggct gaaattggcc aacaagtaca gattgttggg 1020

gatgatctcc ttgtcacgaa tccaaagcgt gtagataagg caatcaagga gaagacctgc 1080

aatgcccttt tgctgaaggt gaatcaaatt ggctctgtca ctgagagcat tgaagctgtc 1140

aaaatgtcca aacgtgctgg ctggggtgtc atggcaagcc accgaagtgg tgagaccgag 1200

gatactttca ttgcagacct ttcagttggt ttggcaacgg gtcagattaa gacaggagct 1260

ccttgcaggt cagaacgtct tgcaaaatat aaccagcttc ttaggattga agaagagctt 1320

ggatcagcag cagtctatgc gggagcaaat ttccgagcac cagtggaacc ttactagatg 1380

cttattacgg ttagcaagaa g 1401

<210> 2

<211> 445

<212> PRT

<213> 梧桐花粉过敏原烯醇化酶(Pla a enolase)

<400> 2

Met Ala Thr Ile Lys Ala Val Lys Ala Arg Gln Ile Phe Asp Ser Arg

1 5 10 15

Gly Asn Pro Thr Val Glu Val Asp Val Thr Ile Ser Asp Gly Thr Leu

20 25 30

Ala Arg Ala Ala Val Pro Ser Gly Ala Ser Thr Gly Ile Tyr Glu Ala

35 40 45

Leu Glu Leu Arg Asp Gly Gly Ser Asp Tyr Leu Gly Lys Gly Val Leu

50 55 60

Lys Ala Val Glu Asn Val Asn Ala Ile Ile Gly Pro Ala Leu Ile Gly

65 70 75 80

Lys Asp Pro Thr Glu Gln Thr Lys Ile Asp Asn Phe Met Val Gln Glu

85 90 95

Leu Asp Gly Thr Val Asn Glu Trp Gly Trp Cys Lys Gln Lys Leu Gly

100 105 110

Ala Asn Ala Ile Leu Ala Val Ser Leu Ala Ile Cys Lys Ala Gly Ala

115 120 125

Ser Val Lys Lys Ile Pro Leu Tyr Lys His Ile Ala Asn Leu Ser Gly

130 135 140

Asn Lys Thr Leu Val Leu Pro Val Pro Ala Phe Asn Val Ile Asn Gly

145 150 155 160

Gly Ser His Ala Gly Asn Lys Leu Ala Met Gln Glu Phe Met Ile Leu

165 170 175

Pro Val Gly Ala Thr Ser Phe Lys Glu Ala Met Lys Met Gly Val Glu

180 185 190

Val Tyr His His Leu Lys Ala Val Ile Lys Lys Lys Tyr Gly Gln Asp

195 200 205

Ala Thr Asn Val Gly Asp Glu Gly Gly Phe Ala Pro Asn Ile Gln Glu

210 215 220

Asn Lys Glu Gly Leu Glu Leu Leu Lys Thr Ala Ile Ala Lys Ala Gly

225 230 235 240

Tyr Thr Gly Lys Val Val Ile Gly Met Asp Val Ala Ala Ser Glu Phe

245 250 255

Tyr Asp Asn Lys Asp Lys Thr Tyr Asp Leu Asn Phe Lys Glu Glu Asn

260 265 270

Asn Asp Gly Ser Gln Lys Ile Ser Gly Asp Ser Leu Lys Asn Val Tyr

275 280 285

Lys Ser Phe Val Thr Asp Tyr Pro Ile Val Ser Ile Glu Asp Pro Phe

290 295 300

Asp Gln Asp Asp Trp Glu His Tyr Ala Lys Leu Thr Ala Glu Ile Gly

305 310 315 320

Gln Gln Val Gln Ile Val Gly Asp Asp Leu Leu Val Thr Asn Pro Lys

325 330 335

Arg Val Asp Lys Ala Ile Lys Glu Lys Thr Cys Asn Ala Leu Leu Leu

340 345 350

Lys Val Asn Gln Ile Gly Ser Val Thr Glu Ser Ile Glu Ala Val Lys

355 360 365

Met Ser Lys Arg Ala Gly Trp Gly Val Met Ala Ser His Arg Ser Gly

370 375 380

Glu Thr Glu Asp Thr Phe Ile Ala Asp Leu Ser Val Gly Leu Ala Thr

385 390 395 400

Gly Gln Ile Lys Thr Gly Ala Pro Cys Arg Ser Glu Arg Leu Ala Lys

405 410 415

Tyr Asn Gln Leu Leu Arg Ile Glu Glu Glu Leu Gly Ser Ala Ala Val

420 425 430

Tyr Ala Gly Ala Asn Phe Arg Ala Pro Val Glu Pro Tyr

435 440 445