组氨酸脂质、组氨酸脂质纳米颗粒及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种组氨酸脂质，组氨酸脂质为化合物A和/或化合物A的盐，化合物A的结构式为

说明书

技术领域

本发明涉及一种组氨酸脂质、组氨酸脂质纳米颗粒及其制备方法和应用。

背景技术

信使核糖核酸(mRNA)是由DNA转录而来的、携带遗传信息能指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸，mRNA的治疗方法在疫苗、肿瘤免疫治疗等领域被广泛研究。在本次新冠疫情中，mRNA疫苗因其开发速度快、保护率和安全性高的特点使mRNA药物受到极大的关注。在用于递送mRNA的载体中，LNP脂质纳米颗粒(Lipid Nanoparticle，LNP)被广泛研究和应用。而目前主流的LNP系统所用的阳离子或可阳离子化的氨基脂质，主要存在生物毒性大、免疫原性强以及内涵体逃逸率低的问题，并且LNP主要递送到肝脏，对其他器官的选择性差。

基于此，如何降低mRNA递送系统的免疫原性、生物毒性以及提高内涵体的逃逸率是急需要解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种组氨酸脂质、组氨酸脂质纳米颗粒及其制备方法和应用。

针对上述现有技术的缺陷，本发明采取的技术方案是：

一种组氨酸脂质，所述组氨酸脂质为化合物A和/或所述化合物A的盐，所述化合物A的结构式为

优选地，所述R

进一步优选地，所述R

更进一步优选地，当所述R

根据一些优选的实施方式，当所述R

进一步优选地，所述R

进一步优选地，所述R

根据一些优选的实施方式，当所述R

进一步优选地，所述R

进一步优选地，所述R

根据一些具体且优选的实施方式，所述R

根据一些具体且优选的实施方式，所述化合物A选自

优选地，所述化合物A的盐的结构式为

进一步优选地，所述酸根选自CF

根据一些具体且优选的实施方式，所述化合物A的盐选自

本发明还提供一种如上所述的组氨酸脂质的制备方法，包括使化合物B与醇反应生成所述化合物A，再选择性地使化合物A与酸反应生成所述化合物A的盐；其中，所述化合物B结构式为

本发明还提供一种如上所述的组氨酸脂质中的一种或多种或者如上所述的制备方法制得的组氨酸脂质中的一种或多种在递送mRNA、siRNA、miRNA或反义寡核苷酸中的一种或多种中的应用。

本发明还提供一种组氨酸脂质纳米颗粒，其包括mRNA和如上所述的组氨酸脂质中的一种或多种或者如上所述的制备方法制得的组氨酸脂质中的一种或多种。

本发明还提供一种如上所述的组氨酸脂质纳米颗粒在递送mRNA、siRNA、miRNA或反义寡核苷酸中的一种或多种中的应用。

本发明的实施，至少具有如下有益效果：

本发明中的组氨酸脂质具有毒性低和免疫原性小的优点，其能够与mRNA形成包封率高、粒径小且均一的组氨酸纳米颗粒，能够用于有效递送mRNA。

附图说明

图1为本发明实施例中的mRNA/HLNP(组氨酸脂质纳米颗粒)的制备示意图；

图2为本发明实施例中的琼脂糖凝胶电泳图；

图3为本发明实施例中的小鼠荧光成像图片，其中，1-5分别为肌肉注射5个mRNA/HLNP样品24小时，小鼠的荧光成像图片；

图4为本发明实施例中的小鼠给药及采血时间示意图；

图5为本发明实施例中的荧光素酶抗体检测示意图。

具体实施方式

在用于递送mRNA的载体中，LNP被广泛应用，但目前的LNP中的可离子化脂质通常是合成的氨基化合物，主要存在毒性高，免疫原性大的问题。为了解决上述问题，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。

一种组氨酸脂质，其为化合物A和/或所述化合物A的盐，化合物A的结构式为

根据本发明，R

进一步地，R

一些实施方式中，当R

作为优选，R

作为优选，R

一些实施方式中，当R

作为优选，R

作为优选，R

根据本发明，在一些具体且优选的实施方式中，R

R

化合物A例如可以为

根据本发明，化合物A的盐的结构式为

在一些具体且优选的实施方式中，化合物A的盐选自

一种组氨酸脂质的制备方法，包括使化合物B与醇反应生成上述化合物A，再选择性地使化合物A与酸反应生成化合物A的盐；其中，化合物B的结构式为

化合物B中的X与化合物A中的X相同；醇为R

根据本发明，控制化合物B与醇的反应温度为0～100℃，例如可以为0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃等。

进一步地，控制化合物B与醇的反应时间为1～50h，例如可以为1h、5h、10h、15h、18h、20h、23h、25h、30h、35h、40h、45h、50h。

根据本发明，化合物B与醇的投料摩尔比为1：(0.1～10)，例如可以为1:0.5、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9等。

一些实施方式中，使化合物B和醇在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶、二异丙基乙基胺和溶剂的存在下进行反应。化合物B与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的投料摩尔比为1:(1～5)，例如可以为1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:5等。化合物B与4-二甲氨基吡啶的投料摩尔比为1：(0.1～1)，例如可以为1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9等。化合物B与二异丙基乙基胺的投料摩尔比为1：(1～10)，例如可以为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9等。

另一些实施方式中，使化合物B和醇在二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶和溶剂的存在下进行反应。化合物B与二环己基碳二亚胺的投料摩尔比为1：(0.5～5)，例如可以为1:0.5、1:1、1:1.5、1:2、1:3、1:4等。化合物B与4-二甲氨基吡啶的投料摩尔比为1：(0.5～5)，例如可以为1:0.5、1:1、1:1.5、1:2、1:3、1:4等。

溶剂包括但不限于二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺中的一种或者多种。

根据本发明，控制化合物A与酸的反应温度为0～50℃，例如可以0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃。

进一步地，控制化合物A与酸的反应时间为0.1～5h，例如可以为0.1h、0.5h、1h、1.5h、2h、3h、4h等。

根据本发明，化合物A与酸的投料摩尔比为1：(0.5～100)，例如可以为1:1、1:2、1:3、1:5、1:10、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:60、1:70等。

根据本发明，使化合物A与酸在溶剂的存在下进行反应。酸包括但不限于三氟乙酸。

一种组氨酸脂质纳米颗粒，其包括mRNA和如上所述的组氨酸脂质。

根据本发明，组氨酸脂质纳米颗粒还包括辅助脂质、胆固醇、聚乙二醇脂质中的一种或者多种。其中，辅助脂质包括但不限于DSPC和/或DOPE，聚乙二醇脂质包括但不限于PEG2000-DMG、PEG2000-C-DMG、PEG2000-DSPE中的一种或者多种。

一种组氨酸脂质纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：

(1)使组氨酸脂质、辅助脂质、胆固醇以及聚乙二醇脂质溶于有机溶剂；

(2)使mRNA溶于缓冲液；

(3)将步骤(1)和步骤(2)所得溶液混合；

(4)将步骤(3)所得产物用PBS缓冲液稀释，超滤。

根据本发明，组氨酸脂质与辅助脂质的投料质量比为1：(0.1～0.5)，例如可以为1:0.2、1:0.25、1:0.3、1:0.35、1:0.4等。组氨酸脂质与胆固醇的投料质量比为1：(0.3～0.8)，例如可以为1:0.4、1:0.45、1:0.45、1:0.5、1:0.55、1:0.6、1:0.7等。组氨酸脂质与聚乙二醇脂质的投料质量比为1：(0.1～0.2)，例如可以为1:0.12、1:0.14、1:0.16、1:0.18等。组氨酸脂质与mRNA的投料质量比为(5～15)：1，例如可以为7:1、8:1、9:1、10:1、12:1、14:1等。

根据本发明，控制步骤(1)的体系中组氨酸脂质的质量浓度为1～10mg/mL，例如可以为2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL等。

根据本发明，控制步骤(2)中的缓冲液的pH为3～4。控制步骤(2)体系中的mRNA的质量浓度为0.1～0.5mg/mL，例如可以为0.15mg/mL、0.2mg/mL、0.25mg/mL、0.3mg/mL等。

根据本发明，控制步骤(4)稀释的倍数为5～15倍，例如可为5、8、10、13等。

根据本发明，控制步骤(4)在0～10℃下超滤至原体积。

以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，但不以任何方式限制本发明。

在没有特别说明的情况下，下述实施例中涉及到的室温指20～25℃。

下述实施例中涉及的化合物A的盐的m/z值仅包含主体部分，而不包括酸根。

下述实施例中涉及的“产率”均指“摩尔产率”。

实施例1

N-叔丁氧羰基-L-组氨酸-9-十七烷基酯(化合物1)和L-组氨酸-9-十七烷基酯双三氟乙酸盐(化合物2)的合成

化合物1和化合物2的合成路线如下：

在25mL反应瓶中加入N-叔丁氧羰基-L-组氨酸(300mg,1.18mmol,1eq.)，9-十七烷醇(840mg,3.3mmol,2.8eq.)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI,563mg,2.95mmol,2.5eq.)，4-二甲氨基吡啶(DMAP,57mg,0.47mmol,0.4eq.)，用三通接头进行20次N

化合物1的表征数据如下：

ESI:m/z＝494.16[M+H]+.

在25mL反应瓶中加入化合物1(124.6mg,0.25mmol)，将瓶内气体用N

化合物2的表征数据如下：

ESI:m/z＝394.38[M+H]+.

实施例2

N-叔丁氧羰基-D-组氨酸-9-十七烷基酯(化合物3)和D-组氨酸-9-十七烷基酯双三氟乙酸盐(化合物4)的合成

化合物3和化合物4的合成路线如下：

在25mL反应瓶中加入N-叔丁氧羰基-D-组氨酸(300mg,1.18mmol,1eq.),9-十七烷醇(840mg,3.3mmol,2.8eq.),EDCI(563mg,2.95mmol,2.5eq.),DMAP(57mg,0.47mmol,0.4eq.),用三通接头进行20次N

ESI:m/z＝494.56[M+H]+.

在25mL反应瓶中加入化合物3(73.75mg,0.15mmol),将瓶内气体用N

ESI:m/z＝394.34[M+H]+.

1H NMR(400MHz,DMSO-d

实施例3

N-叔丁氧羰基-L-组氨酸-(2-己基)-癸基酯(化合物5)和L-组氨酸-(2-己基)-癸基酯双三氟乙酸盐(化学物6)的合成

化合物5和化合物6的合成路线如下：

在25mL反应瓶中加入N-叔丁氧羰基-L-组氨酸(300mg,1.18mmol,1eq.),EDCI(563mg,2.95mmol,2.5eq.),DMAP(57mg,0.47mmol,0.4eq.),用三通接头进行20次N

化合物5的表征数据如下：

ESI:m/z＝480.50[M+H]+.

在25mL反应瓶中加入化合物5(300mg,0.63mmol),将瓶内气体用N

化合物6的表征数据如下：

ESI:m/z＝380.43[M+H]+.

实施例4

N-叔丁氧羰基-L-组氨酸-油基酯(化合物7)和L-组氨酸-油基酯双三氟乙酸盐(化合物8)的合成

化合物7和化合物8的合成路线如下：

在25mL反应瓶中加入N-叔丁氧羰基-L-组氨酸(300mg,1.18mmol,1eq.),油醇(1.4mL,3.54mmol,3.0eq.),EDCI(676mg,3.53mmol,3.0eq.),DMAP(57.5mg,0.47mmol,0.4eq.),用三通接头进行20次N

化合物7的表征数据如下：

ESI:m/z＝506.46[M+H]+.

在25mL反应瓶中加入化合物7(260mg,0.51mmol),将瓶内气体用N

化合物8的表征数据如下：

ESI:m/z＝406.44[M+H]+.

实施例5

N-乙酰基-L-组氨酸-9-十七烷基酯(化合物9)的合成

化合物9的合成路线如下：

在25mL反应瓶中加入9-十七烷醇(300mg,1.17mmol,1eq.)及4mL DCM，冰浴10min后，将分散于3mL DCM中的N-乙酰基-L-组氨酸(277mg,1.29mmol,1.1eq.)加入反应瓶,紧接着将2mL的二环己基碳二亚胺(DCC,265.48mg,1.29mmol,1.1eq.)的DCM溶液及2mL的DMAP(200.07mg,1.64mmol,1.4eq.)的DCM溶液一并加入反应瓶中,反应温度自然升至室温后，50℃水浴加热，LC-MS跟踪反应，24h后停止反应。将反应混合物过滤，除去生成的白色沉淀，用40mL DCM洗涤,所得滤液用40mL 1M的稀盐酸水溶液进行洗涤，以去除DMAP。然后再加入40mL饱和NaHCO

化合物9的表征数据如下：

ESI:m/z＝436.55[M+H]+.

实施例6

1、包载mRNA的组氨酸脂质纳米颗粒[Histidine-Lipid Nanoparticle(HLNP)]的制备

a)脂质组分处理：取组氨酸脂质(Histidine-Lipid)与辅助脂质(包括但不限于DSPC、DOPE等)、胆固醇(Chol)和PEG-Lipid(包括但不限于PEG2k-DMG、PEG2000-C-DMG、PEG2000-DSPE等)溶于无水乙醇(EtOH)中。

b)mRNA处理：取mRNA溶于pH 3-4的缓冲液中。

c)mRNA/HLNP制备：将步骤a和b所得溶液通过微流控混合。

d)Buffer置换：步骤c所得产物用pH＝7.4的PBS缓冲液稀释10倍后，在4℃超滤至原体积，重复两次。

上述组氨酸脂质纳米颗粒的示意图如图1所示。

2、mRNA/HLNP处方表(mg)见下表1。

表1

3、表征

按上表1拟定处方，采用1所述工艺制备了5个mRNA/HLNP样品，用马尔文激光粒度仪检测粒径、PDI及Zeta电位，相关检测结果如下表2所示。

表2

4、包封率(琼脂糖凝胶电泳)

通过琼脂糖凝胶电泳对上述mRNA/HLNP样品中mRNA的包封率进行考察，电泳条件如下表3所示，琼脂糖凝胶电泳图见图2，其中，Lane a为阳性对照，Lane b为阴性对照，Lane1-5为mRNA/HLNP样品。

表3

由图2可知，Lane 1-5均未见明显亮条带，说明所有mRNA/HLNP样品中均没有或极少

5、动物实验

5.1小鼠活体荧光成像

BABL/C小鼠肌肉注射含20μg mRNA的mRNA/HLNP样品，每个样品注射3只小鼠，24h后每只小鼠腹腔注射荧光素钾盐溶液5分钟后，腹腔注射舒泰50和赛拉嗪混合药物麻醉小鼠，等待5分钟后，使用小动物成像仪，选取luc频道，曝光1分钟后拍摄照片，结果如下图3所示。

由图3可知，所有肌肉注射了mRNA/HLNP样品的小鼠，24h后均出现荧光表达，说明基于组氨酸的HLNP可有效递送Fluc mRNA进入细胞，并在小鼠体内翻译成荧光蛋白。

5.2免疫原性实验(荧光素酶抗体检测ELISA)

小鼠通过肌肉注射给药两次，每个样品注射3只小鼠，每只小鼠每次注射含20μgmRNA的mRNA/HLNP样品。在第二次给药后一周，对小鼠进行眼眶静脉丛采血100-200微升血液，置于4℃冰箱过夜后分离血清(给药及采血时间见图4)，在酶标板上包被荧光素酶，室温过夜后，对小鼠血清稀释后加入到酶标板(使用荧光素酶的抗体作为阳性对照，使用磷酸盐和吐温20的混合液作为阴性对照)，充分反应后洗板，加入IgG-HRP抗体，充分反应后洗板，加入TMB反应液，充分反应后加入终止液终止反应，在酶标仪上选取450nm波长读取吸光值，对荧光素酶抗体进行检测。

结果显示(图5)，其中，图5中的PC为阳性对照，PC1:250、PC1：500以及PC1:1000分别表示稀释倍数，NC为阴性对照，NS为生理盐水。采用His-C17和His-C16制备的mRNA/HLNP给药2次后，在小鼠血清中均未检出荧光素酶抗体，未显示出免疫原性。相对的，以ModernaLNP处理的小鼠血清中检出抗体，显示出一定的免疫原性。根据文献报道Moderna LNP具有引起免疫反应的主要原因是其中的可离子化脂质，但我们的His-C16LNP、His-C17LNP未显示明显免疫原性，说明基于组氨酸合成的可离子化脂质几乎没有免疫原性。

尽管本发明描述了所述组合物和方法的某些实施例，并且出于说明的目的已经阐述了很多细节，但是对于本领域技术人员显而易见的是，这些组合物和方法易受其他实施例的影响，并且某些细节在不脱离本发明的基本原理的情况下，可以随本文中描述的实施方式进行改变。