一种利用CdTe量子点检测喹乙醇的荧光免疫分析方法

摘要

本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种利用CdTe量子点检测喹乙醇的荧光免疫分析方法。本发明提供的一种CdTe量子点标记喹乙醇抗原的方法，包括如下步骤：向喹乙醇抗原溶液中加入EDC和NHS，静置，然后加入CdTe量子点，放置反应；所述CdTe量子点的粒径范围为8‑15nm；经过大量的摸索实验发现，喹乙醇抗原能将CdTe量子点的表面缺陷覆盖，形成荧光性能比较稳定的荧光标记物，荧光强度增加500‑1000。

说明书

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种利用CdTe量子点检测喹乙醇的荧光免疫分析方法。

背景技术

喹乙醇(Olaquindox，Ola),是一种抗菌促进生长剂,又名喹酰胺醇、倍育诺、快育灵。由于具有促进蛋白质同化作用、提高饲料转化率及优良的抗菌效果,广泛用于猪、牛、羊、马、兔等家畜生长和抗菌治疗,但若滥用Ola易造成细菌耐药性增加,人类误食Ola污染的禽畜肉可能感染具耐药性的细菌,进而危害健康。研究表明对动物的肝脏肾脏造成严重器质性损害；也可对动物的免疫器官造成损害及对红细胞免疫功能产生抑制；还可诱导动物生精细胞的凋亡；现代毒理学研究表明,Ola及其代谢产物3-甲基-喹噁啉-2-羧酸具有强的蓄积毒性、致畸作用。欧盟已于1998年禁止Ola应用于可食性动物中；我国农业农村部规定自2019年5月起,停止经营、使用Ola原料药及各种制剂,但一些养殖业仍存在滥用情况。为了维护消费者的权益、保障人民身体健康，加强对食品安全的监督管理，研发更为准确、便捷、经济的食品安全检测方法已经是迫在眉睫。

目前主要的检测方法是液相色谱串联质谱法。该方法灵敏、准确性高，但仪器价格昂贵，前处理复杂，需要专业的技术人员操作。近年来，QDs标记技术与ELISA相结合而成的量子点酶联免疫分析技术，可实现对特定靶标(抗原分子)如重金属、致病菌、生物毒素、农兽药残留及化学污染物等超微量测定，并且具有操作简便、快速准确、特异灵敏、廉价高效、前处理简单以及无需特殊检测设备等优点，被越来越多的研究者所关注，QDs在食品安全检测领域显示出了巨大的应用价值和光明前景。与免疫检测技术方法的结合，将建立起更多高效、简便、经济的新型免疫检测方法。然而，目前还未有荧光免疫分析方法检测喹乙醇的相关研究，为此，本发明提出了一种利用CdTe量子点检测喹乙醇的荧光免疫分析方法，填补荧光免疫分析方法检测喹乙醇的空白，为食品安全检测的进一步发展提供了强有力的技术支持。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于提出了一种利用CdTe量子点检测喹乙醇的荧光免疫分析方法。

为此，本发明提供了如下的技术方案：

一种CdTe量子点标记喹乙醇抗原的方法，包括如下步骤：向喹乙醇抗原溶液中加入EDC和NHS，静置，然后加入CdTe量子点，放置反应；所述CdTe量子点的粒径范围为8-15nm。

可选的，取浓度为0.1-0.8mg/mL的喹乙醇抗原溶液0.1-0.5ml，加入浓度为0.05-0.30mol/L的EDC溶液20-60μL，和加入浓度为0.05-0.30mol/L的NHS溶液20-60μL，在温度10-26℃下静置8-20min，然后加入浓度为0.001-0.005mol/L的CdTe量子点溶液0.05-0.5mL，加入缓冲液定容至2-10mL，然后在温度为0-6℃下放置36-48h；

可选的，取浓度为0.5mg/mL的喹乙醇抗原溶液0.2mL，加入浓度为0.10mol/L的EDC溶液50μL，和加入浓度为0.1mol/L的NHS溶液50μL，在温度10-26℃下静置15min，然后加入浓度为0.001mol/L的CdTe量子点溶液0.1mL，加入缓冲液定容至5mL，然后在温度为0-6℃下放置36-48h；

可选的，当CdTe量子点的粒径是8nm时，CdTe量子点溶液的浓度为0.005mol/L，加入的体积为0.15mL，喹乙醇抗原溶液的浓度为0.3mg/mL，加入的体积为0.2mL，EDC溶液的浓度为0.1mol/L，加入的体积为50μL，NHS溶液的浓度为0.1mol/L，加入的体积为50μL；

可选的，当CdTe量子点的粒径是11nm时，CdTe量子点溶液的浓度为0.004mol/L，加入的体积为0.20mL，喹乙醇抗原溶液的浓度0.20mg/mL，加入的体积为0.3mL，EDC溶液的浓度为0.2mol/L，加入的体积为40μL，NHS溶液的浓度为0.2mol/L，加入的体积为40μL；

可选的，当CdTe量子点的粒径15nm时，CdTe量子点溶液的浓度为0.005mol/L，加入的体积为0.15mL，喹乙醇抗原溶液的浓度为0.45mg/mL，加入的体积为0.2mL，EDC溶液的浓度为0.1mol/L，加入的体积为50μL，NHS溶液的浓度为0.1mol/L，加入的体积为50μL。

所述的方法标记得到的CdTe量子点标记的喹乙醇抗原在检测喹乙醇中的用途；

可选的，在检测动物肉或动物尿液中喹乙醇的用途；

可选的，在检测猪肉、牛肉、羊肉、马肉、兔肉、猪尿、牛尿、羊尿、马尿或兔尿中的用途。

一种利用CdTe量子点检测喹乙醇的荧光免疫分析方法，包括如下步骤：

包被：将喹乙醇抗体作为包被原，用包被缓冲液稀释包被原得到的包被液，然后包被酶标板、洗涤；

封闭：用封闭液封闭包被后的酶标板，洗涤；

绘制标准曲线：向封闭后的酶标板中加入系列标准浓度的喹乙醇标准溶液和CdTe量子点标记的喹乙醇抗原溶液稀释液进行间接竞争反应，同时设置不添加喹乙醇的对照溶液，洗板，然后检测荧光度值，喹乙醇标准溶液浓度的lg值作为横坐标，以结合率为纵坐标，绘制标准曲线；所述CdTe量子点标记的喹乙醇抗原溶液为权利要求1-2任一项所述的方法标记得到；所述结合率＝喹乙醇标准溶液的荧光度值/不添加喹乙醇的对照溶液的荧光度值×100％；

测定：向封闭后的酶标板中加入待测样品和CdTe量子点标记的喹乙醇抗原溶液稀释液进行间接竞争反应，洗板，然后检测荧光度值，计算结合率，将所得结合率代入所述标准曲线计算得到待测样品的浓度；

可选的，所述包被缓冲液为0.01-0.05mol/L的pH7.0-7.8的PBS、0.005-0.03mol/L的pH7.4-7.8的PBST、0.005-0.05mol/L的pH8.0-10.2的CBS或0.005-0.03mol/L的pH7.8-9.6的Tris-HCl；

可选的，所述包被缓冲液为0.01mol/L的pH7.4的PBS、0.0lmol/L的pH7.4的PBST、0.05mol/L的pH9.6的CBS或0.01mol/L的pH8.0的Tris-HCl；

可选的，所述包被缓冲液为0.01mol/L的pH8.0的Tris-HCl；

可选的，将喹乙醇抗体作为包被原，用包被缓冲液稀释包被原浓度为2-5μg/mL，得到包被液，然后按20-50微升/孔加入酶标板，于温度2-10℃下包被5-16h。

可选的，所述封闭液为0.1-2％v/v的卵清蛋白

可选的，所述封闭液为0.1％v/v、0.5％v/v、1％v/v或2％v/vOVA；

可选的，所述封闭液为0.5％v/v OVA；

可选的，用封闭液按照20-50微升/孔加入包被后的酶标板中，封闭的条件为温度10-20℃，时间5-15小时。

可选的，所述绘制标准曲线步骤中，系列标准浓度的喹乙醇标准溶液和CdTe量子点标记的喹乙醇抗原溶液稀释液采用第一稀释液稀释得到，所述系列标准浓度的喹乙醇标准溶液的浓度范围为10

可选的，向封闭后的酶标板中加入系列标准浓度的喹乙醇标准溶液20-50微升/孔和CdTe量子点标记的喹乙醇抗原溶液稀释液20-50微升/孔，调pH7.4，37℃反应至少150min；

可选的，向封闭后的酶标板中加入系列标准浓度的喹乙醇标准溶液50微升/孔和CdTe量子点标记的喹乙醇抗原溶液稀释液50微升/孔，调pH7.4，37℃反应至少150min，用荧光酶标仪在激发波长365nm和发射波长625nm下检测荧光度值；

可选的，当CdTe量子点粒径是8nm时，用包被缓冲液稀释包被原浓度为2μg/mL，CdTe量子点标记的喹乙醇抗原溶液稀释4体积倍；

可选的，当CdTe量子点粒径是11nm时，用包被缓冲液稀释包被原浓度为3μg/mL，CdTe量子点标记的喹乙醇抗原溶液稀释8体积倍；

可选的，当CdTe量子点粒径是15nm时，用包被缓冲液稀释包被原浓度为5μg/mL，CdTe量子点的喹乙醇抗原溶液稀释16体积倍。

一种利用CdTe量子点检测喹乙醇的荧光免疫分析试剂盒，包括如下独立包装的试剂：

第一稀释液：含有0.1％v/v的Tween-20，0.8mol/L的NaCl，0.5％v/v的PBS缓冲液，pH为7.4；

系列标准浓度的喹乙醇标准溶液：用第一稀释液稀释喹乙醇得到的10

CdTe量子点标记的喹乙醇抗原溶液：权利要求1-2任一项所述的方法标记得到；

封闭液：0.1-2％v/v OVA；

包被缓冲液：0.01-0.05mol/L的pH7.0-7.8的PBS、0.005-0.03mol/L的pH7.4-7.8的PBST、0.005-0.05mol/L的pH8.0-10.2的CBS或0.005-0.03mol/L的pH7.8-9.6的Tris-HCl中的任意一种。

所述的CdTe量子点标记喹乙醇抗原的方法或所述的利用CdTe量子点检测喹乙醇的荧光免疫分析试剂盒在检测喹乙醇中的用途；

可选的，在检测动物肉或动物尿液中喹乙醇的用途；

可选的，在检测猪肉、牛肉、羊肉、马肉、兔肉、猪尿、牛尿、羊尿、马尿或兔尿中喹乙醇的用途。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的一种CdTe量子点标记喹乙醇抗原的方法，包括如下步骤：向喹乙醇抗原溶液中加入EDC和NHS，静置，然后加入CdTe量子点，放置反应；所述CdTe量子点的粒径范围为8-15nm；经过大量的摸索实验发现，CdTe量子点的粒径范围为8-15nm时，喹乙醇抗原能将CdTe量子点的表面缺陷覆盖，可以形成荧光性能比较稳定的荧光标记物。而当CdTe量子点的粒径小于8nm，则喹乙醇抗原会过多的吸附在CdTe量子点的表面，形成新的表面缺陷，荧光标记物不稳定；当CdTe量子点的粒径大于15nm，喹乙醇抗原不能完全的覆盖在CdTe量子点的表面，且该标记物放置24h，出现明显的黄色沉淀，十分不利于间接竞争荧光免疫分析方法的建立。

2.本发明提供的一种利用CdTe量子点检测喹乙醇的荧光免疫分析方法，通过利用上述粒径范围为8-15nm的CdTe量子点标记喹乙醇抗原进行荧光免疫检测喹乙醇，具有前处理简单，不需要精密的大型精密仪器设备，特别是与胶体金免疫层析方法相比，具有灵敏度高，解决假阳性的优势。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实验例1中CdTe量子点标记喹乙醇抗原溶液的体系荧光强度与试剂稀释比的关系；

图2是本发明实验例1中间接竞争FIA分析方法的条件优化；

图3是本发明实验例2中的标准曲线。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

下述实施例中涉及的仪器和试剂：多功能酶标仪(SpectraMax i3x，美国MD公司)；F-7000型荧光分光光度计(日立公司)；U3900型紫外可见分光光度计(日立公司)；pHS-3C酸度计(上海雷磁公司)；GZX-9240MBE电热恒温干燥箱(上海博迅实业有限公司)；79-1加热磁力搅拌器(上海浦东物理光学仪器厂)；碲粉(Te99.999％,中国医药上海化学试剂公司)；氯化镉(分析纯，中国医药上海化学试剂公司)；硼氢化钠(96％，中国医药上海化学试剂公司)；巯基乙酸(分析纯，中国医药上海化学试剂公司)；氢氧化钠(分析纯，中国医药上海化学试剂公司)；罗丹明6G(分析纯，阿拉丁试剂)；实验用水由Milli-Q水处理系统(Millipore)制的。喹乙醇标准品(sigma公司)，喹乙醇抗体(5mg/mL)，喹乙醇抗原(6.2mg/mL)均购置北京维德维康科技有限公司。EDC的中文名称为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，NHS的中文名称为N-羟基磺基琥珀酰亚胺，OVA的中文名称为卵清蛋白。

CdTe量子点的制备参照“微波合成水溶性CdTe量子点的制备与表征”[J].农产品质量安全，2015，2，51-55，张金艳，魏益华，等。

下述实施例中的待测样品为取猪尿样品50mL或猪肉样品50g，NaOH溶液(1mol/L)溶解处理，过滤离心(高速离心3min，转速设置20000转/min)，取上清，供检测用。

实施例1CdTe量子点标记喹乙醇抗原的方法

取浓度为0.5mg/mL的喹乙醇抗原溶液0.2ml，加入浓度为0.10mol/L的EDC溶液50μL，和加入浓度为0.1mol/L的NHS溶液50μL，在温度10℃下静置15min，然后加入浓度为0.001mol/L的CdTe量子点溶液0.1ml(所述量子点的粒径为10nm)，加入缓冲液定容至2ml，然后在温度为4℃下放置36h。

实施例2CdTe量子点标记喹乙醇抗原的方法

取浓度为0.3mg/mL的喹乙醇抗原溶液0.2ml，加入浓度为0.10mol/L的EDC溶液50μL，和加入浓度为0.1mol/L的NHS溶液50μL，在温度10℃下静置8min，然后加入浓度为0.005mol/L的CdTe量子点溶液0.15ml(所述量子点的粒径为8nm)，加入缓冲液定容至5ml，然后在温度为4℃下放置48h。

实施例3CdTe量子点标记喹乙醇抗原的方法

取浓度为0.2mg/mL的喹乙醇抗原溶液0.3ml，加入浓度为0.20mol/L的EDC溶液40μL，和加入浓度为0.2mol/L的NHS溶液40μL，在温度20℃下静置15min，然后加入浓度为0.004mol/L的CdTe量子点溶液0.20ml(所述量子点的粒径为11nm)，加入缓冲液定容至8ml，然后在温度为4℃下放置48h。

实施例4CdTe量子点标记喹乙醇抗原的方法

取浓度为0.45mg/mL的喹乙醇抗原溶液0.2ml，加入浓度为0.10mol/L的EDC溶液50μL，和加入浓度为0.1mol/L的NHS溶液50μL，在温度18℃下静置15min，然后加入浓度为0.005mol/L的CdTe量子点溶液0.15ml(所述量子点的粒径为15nm)，加入缓冲液定容至10ml，然后在温度为4℃下放置48h。

实施例5利用CdTe量子点检测喹乙醇的荧光免疫分析试剂盒

本实施例的利用CdTe量子点检测喹乙醇的荧光免疫分析试剂盒，包括：

第一稀释液：含有0.1％v/v的Tween-20，0.8mol/L的NaCl，0.5％v/v的PBS缓冲液，pH为7.4；

系列标准浓度的喹乙醇标准溶液：用第一稀释液稀释喹乙醇得到的10

CdTe量子点标记的喹乙醇抗原溶液：实施例1所述的方法标记得到；

封闭液：0.1％v/v OVA；

包被缓冲液：0.01mol/L的pH7.4的PBS。

实施例6利用CdTe量子点检测喹乙醇的荧光免疫分析试剂盒

本实施例的利用CdTe量子点检测喹乙醇的荧光免疫分析试剂盒，包括：

第一稀释液：含有0.1％v/v的Tween-20，0.8mol/L的NaCl，0.5％v/v的PBS缓冲液，pH为7.4；

系列标准浓度的喹乙醇标准溶液：用第一稀释液稀释喹乙醇得到的10

CdTe量子点标记的喹乙醇抗原溶液：实施例2所述的方法标记得到；

封闭液：0.5％v/v的OVA；

包被缓冲液：0.0lmol/L的pH7.4的PBST。

实施例7利用CdTe量子点检测喹乙醇的荧光免疫分析试剂盒

本实施例的利用CdTe量子点检测喹乙醇的荧光免疫分析试剂盒，包括：

第一稀释液：含有0.1％v/v的Tween-20，0.8mol/L的NaCl，0.5％v/v的PBS缓冲液，pH为7.4；

系列标准浓度的喹乙醇标准溶液：用第一稀释液稀释喹乙醇得到的10

CdTe量子点标记的喹乙醇抗原溶液：实施例3所述的方法标记得到；

封闭液：1％v/v的OVA；

包被缓冲液：0.01mol/L的pH8.0的Tris-HCl。

实施例8利用CdTe量子点检测喹乙醇的荧光免疫分析试剂盒

本实施例的利用CdTe量子点检测喹乙醇的荧光免疫分析试剂盒，包括：

第一稀释液：含有0.1％v/v的Tween-20，0.8mol/L的NaCl，0.5％v/v的PBS缓冲液，pH为7.4；

系列标准浓度的喹乙醇标准溶液：用第一稀释液稀释喹乙醇得到的10

CdTe量子点标记的喹乙醇抗原溶液：实施例4所述的方法标记得到；

封闭液：2％v/v OVA；

包被缓冲液：0.05mol/L的pH9.6的CBS。

实施例9利用CdTe量子点检测喹乙醇的荧光免疫分析方法

本实施例利用实施例5的试剂盒提供了一种利用CdTe量子点检测喹乙醇的荧光免疫分析方法，包括如下步骤：

(1)包被：

喹乙醇抗体采用包被缓冲液稀释至喹乙醇抗体浓度为4μg/mL，得到包被液，然后在酶标板的每孔中加20微升包被液，4℃包被过夜(10小时)，pH7.4的PBS溶液洗涤3次；

(2)封闭：

按照20微升/孔加封闭液至包被后的酶标板中，封闭的条件为温度10℃，时间5小时，pH7.4的PBS溶液洗涤3次；

(3)绘制标准曲线：

向封闭后的酶标板中加入系列标准浓度的喹乙醇标准溶液(10

(4)测定

向封闭后的酶标板中加入待测样品(其加入的体积与前述“(3)绘制标准曲线”中系列标准浓度的喹乙醇标准溶液加入的体积相同)和CdTe量子点标记的喹乙醇抗原溶液稀释液(其稀释倍数和加入的体积均与前述“(3)绘制标准曲线”中的相同)，然后将得到的反应体系用0.1mol/L的HCl或0.1mol/L的NaOH调pH值为7.4，37℃反应150min，pH7.4的PBS溶液洗涤3次，然后用荧光酶标仪在激发波长365nm和发射波长625nm下检测荧光度值，根据上述结合率公式计算待测样品的结合率(结合率＝待测样品的荧光度值/不添加喹乙醇的对照溶液的荧光度值×100％)，然后将计算的结合率代入上述标准曲线计算得到待测样品的浓度。

实施例10利用CdTe量子点检测喹乙醇的荧光免疫分析方法

本实施例利用实施例6的试剂盒提供了一种利用CdTe量子点检测喹乙醇的荧光免疫分析方法，包括如下步骤：

(1)包被：

喹乙醇抗体采用包被缓冲液稀释至喹乙醇抗体浓度为2μg/mL，得到包被液，然后在酶标板的每孔中加50微升包被液，4℃包被12小时，pH7.4的PBS溶液洗涤3次；

(2)封闭：

按照50微升/孔加封闭液至包被后的酶标板中，封闭的条件为温度20℃，时间15小时，pH7.4的PBS溶液洗涤3次；

(3)绘制标准曲线：

向封闭后的酶标板中加入系列标准浓度的喹乙醇标准溶液(10

(4)测定

向封闭后的酶标板中加入待测样品(其加入的体积与前述“(3)绘制标准曲线”中系列标准浓度的喹乙醇标准溶液加入的体积相同)和CdTe量子点标记的喹乙醇抗原溶液稀释液(其稀释倍数和加入的体积均与前述“(3)绘制标准曲线”中的相同)，然后将得到的反应体系用0.1mol/L的HCl或0.1mol/L的NaOH调pH值为7.4，37℃反应150min，pH7.4的PBS溶液洗涤3次，然后用荧光酶标仪在激发波长365nm和发射波长625nm下检测荧光度值，根据上述结合率公式计算待测样品的结合率(结合率＝待测样品的荧光度值/不添加喹乙醇的对照溶液的荧光度值×100％)，将待测样品的结合率代入上述标准曲线计算得到待测样品的浓度。

实施例11利用CdTe量子点检测喹乙醇的荧光免疫分析方法

本实施例利用实施例7的试剂盒提供了一种利用CdTe量子点检测喹乙醇的荧光免疫分析方法，包括如下步骤：

(1)包被：

喹乙醇抗体采用包被缓冲液稀释至喹乙醇抗体浓度为3μg/mL，得到包被液，然后在酶标板的每孔中加50微升包被液，2℃包被16小时，pH7.4的PBS溶液洗涤2次；

(2)封闭：

按照50微升/孔加封闭液至包被后的酶标板中，封闭的条件为温度15℃，时间10小时，pH7.4的PBS溶液洗涤3次；

(3)绘制标准曲线：

向封闭后的酶标板中加入系列标准浓度的喹乙醇标准溶液(10

(4)测定

向封闭后的酶标板中加入待测样品(其加入的体积与前述“(3)绘制标准曲线”中系列标准浓度的喹乙醇标准溶液加入的体积相同)和上述的CdTe量子点标记的喹乙醇抗原溶液稀释液(其稀释倍数和加入的体积均与前述“(3)绘制标准曲线”中的相同)，然后将得到的反应体系用0.1mol/L的HCl或0.1mol/L的NaOH调pH值为7.4，37℃反应150min，pH7.4的PBS溶液洗涤3次，然后用荧光酶标仪在激发波长365nm和发射波长625nm下检测荧光度值，根据上述结合率公式计算待测样品的结合率(结合率＝待测样品的荧光度值/不添加喹乙醇的对照溶液的荧光度值×100％)，将待测样品的结合率代入上述标准曲线计算得到待测样品的浓度。

实施例12利用CdTe量子点检测喹乙醇的荧光免疫分析方法

本实施例利用实施例8的试剂盒提供了一种利用CdTe量子点检测喹乙醇的荧光免疫分析方法，包括如下步骤：

(1)包被：

喹乙醇抗体采用包被缓冲液稀释至喹乙醇抗体浓度为5μg/mL，得到包被液，然后在酶标板的每孔中加50微升包被液，10℃包被5小时，pH7.4的PBS溶液洗涤1次；

(2)封闭：

按照50微升/孔加封闭液至包被后的酶标板中，封闭的条件为温度15℃，时间10小时，pH7.4的PBS溶液洗涤3次；

(3)绘制标准曲线：

向封闭后的酶标板中加入系列标准浓度的喹乙醇标准溶液(10

(4)测定

向封闭后的酶标板中加入待测样品(其加入的体积与前述“(3)绘制标准曲线”中系列标准浓度的喹乙醇标准溶液加入的体积相同)和上述的CdTe量子点标记的喹乙醇抗原溶液稀释液(其稀释倍数和加入的体积均与前述“(3)绘制标准曲线”中的相同)，然后将得到的反应体系用0.1mol/L的HCl或0.1mol/L的NaOH调pH值为7.4，37℃反应150min，pH7.4的PBS溶液洗涤3次，然后用荧光酶标仪在激发波长365nm和发射波长625nm下检测荧光度值，根据上述结合率公式计算待测样品的结合率(结合率＝待测样品的荧光度值/不添加喹乙醇的对照溶液的荧光度值×100％)，将待测样品的结合率代入上述标准曲线计算得到待测样品的浓度。

实验例1

1、量子点标记抗原的性能鉴定

标记好的抗原一般采用F/P的比值来鉴定其性能。F/P比值代表CdTe量子点和喹乙醇抗原的结合比率。按照实施例1的步骤实施，原料的浓度和体积(包括CdTe量子点的粒径)按照下表1选择，将制备的CdTe量子点标记喹乙醇抗原用紫外分光光度计分别测定280nm(蛋白质的特异吸收峰)和450nm(标记CdTe量子点的特异吸收峰)的荧光度值。F/P值位于1-5之间方便建立荧光免疫分析方法。选择最优的复合物颜色为澄清透明的黄色液体，而且没有沉淀浑浊现象出现，F/P值稳定，4℃冷藏三周，荧光强度值和最大发射峰位变化不大，将CdTe量子点标记喹乙醇抗原溶液逐级稀释(pH7.4的PBS)后测其荧光强度，其荧光强度和该偶联物的浓度具有良好的线性关系，如图1所示，线性方程为I＝2681.2C+35.178，线性范围是1︰2.5-1︰96相关系数R

实验结果：

本实验进行了大量的摸索，实验发现，不同配比的CdTe量子点、喹乙醇抗原、EDC、NHS的使用量，喹乙醇抗原包覆在不同粒径的CdTe量子点的表面不同，F/P值出现规律性的变化，

当CdTe量子点的粒径是8nm时，CdTe量子点溶液的浓度为0.005mol/L，加入的体积为0.15mL，喹乙醇抗原溶液的浓度为0.3mg/mL，加入的体积为0.2mL，EDC溶液的浓度为0.1mol/L，加入的体积为50μL，NHS溶液的浓度为0.1mol/L，加入的体积为50μL，是最佳的配比；

当CdTe量子点的粒径是11nm时，CdTe量子点溶液的浓度为0.004mol/L，加入的体积为0.20mL，喹乙醇抗原溶液的浓度0.20mg/mL，加入的体积为0.3mL，EDC溶液的浓度为0.2mol/L，加入的体积为40μL，NHS溶液的浓度为0.2mol/L，加入的体积为40μL，是最佳的配比；

当CdTe量子点的粒径15nm时，CdTe量子点溶液的浓度为0.005mol/L，加入的体积为0.15mL，喹乙醇抗原溶液的浓度为0.45mg/mL，加入的体积为0.2mL，EDC溶液的浓度为0.1mol/L，加入的体积为50μL，NHS溶液的浓度为0.1mol/L，加入的体积为50μL，是最佳的配比。

具体结果如下表：

表1

2、CdTe量子点标记抗原与喹乙醇抗体最佳工作浓度的选择。

选择获得较大荧光值的CdTe量子点标记喹乙醇抗原与喹乙醇抗体浓度为间接竞争荧光免疫分析方法的最佳工作浓度，按照实施例10实施，区别在于采用下述表格2-4中的CdTe量子点标记抗原(CdTe-ola)(包括CdTe量子点粒径和稀释度选择)与喹乙醇抗体浓度，检测的荧光度值见下述表2-4。

结果发现：

CdTe量子点标记抗原和喹乙醇抗体最佳工作浓度的选择为：

CdTe粒径是8nm时，喹乙醇抗体最佳工作浓度为2μg/mL，CdTe量子点标记喹乙醇抗原溶液最佳稀释度1：4(稀释4体积倍)；当CdTe粒径是11nm时，喹乙醇抗体最佳工作浓度为3μg/mL，CdTe量子点标记喹乙醇抗原溶液最佳稀释度1：8(稀释8体积倍)；当CdTe粒径是15nm时，喹乙醇抗体最佳工作浓度为5μg/mL,CdTe量子点标记喹乙醇抗原溶液最佳稀释度1：16(稀释16体积倍)。

表2喹乙醇抗体与标记抗原最佳工作浓度的选择(8nm)

表3喹乙醇抗体与标记抗原最佳工作浓度的选择(11nm)

表4喹乙醇抗体与标记抗原最佳工作浓度的选择(15nm)

2、包被介质的影响

按照实施例10实施，区别在于分别以0.05mol/L的pH9.6的CBS、0.01mol/L的pH7.4的PBS、0.0lmol/L的pH7.4的PBST和0.01mol/L的pH8.0的Tris-HCl稀释包被原。

实验结果，实验发现，0.01mol/L的pH8.0的Tris-HCl作为包被缓冲液，所测得荧光强度较高，且同时该组的线性关系最好。0.01mol/L的pH7.4的PBS、0.0lmol/L的pH7.4的PBST和0.05mol/L的pH9.6的CBS稀释包被原反应效果分别次之。

3、包被时间优化

按照实施例10中步骤(1)-步骤(3)实施，区别在于包被时间为在4℃条件下喹乙醇抗体包被时间5h，8h，10h，12h，16h。

实验结果如图2所示(图中从左至右的荧光强度结果依次对应5h，8h，10h，12h，16h)，荧光强度从5h-12h，出现逐渐增强现象，而后趋于稳定。包被时间在12h即可达到最大，因此为了方便安排实验，本发明选择4℃包被过夜。

4、反应时间的优化

按照实施例10中步骤(1)-步骤(3)实施，区别在于反应时间为37℃下反应30、60、90、150、180min。

实验结果如图2所示(图中从左至右的荧光强度结果依次对应30、60、90、150、180min)，开始反应150min反应最大，随后反应缓慢，荧光强度趋于稳定。150min后再延长反应时间，结合复合物的荧光强度变化不大。故本发明选择免疫反应的时间为150min。

5、pH值的优化

溶液pH值的大小，既影响待测物质的分子结构，也可以影响抗体或抗原的分子结构，从而影响反应的灵敏度，故本实验按照实施例10中步骤(1)-步骤(3)实施，区别在于调pH步骤中，用0.1mol/L的HCl调节或0.1mol/L的NaOH调pH值分别为6.5、7.0、7.8值。

结果如图2所示(图中从左至右的荧光强度结果依次对应6.5、7.0、7.8)，体系在中性和弱碱性环境中的荧光强度差值较大，小于6.5或大于8.0荧光强度差值均较小，pH＝7.4常用的PBS溶液来控制酸度，故本发明选择pH＝7.4。

6、第一稀释液中离子强度的优化

按照实施例10中步骤(1)-步骤(3)实施，区别在于分别用含有0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0mol/L的NaCl的PBS(0.5％体积比)缓冲溶液(pH7.4)，以此稀释系列标准浓度的喹乙醇标准液和CdTe量子点标记的喹乙醇抗原溶液。

结果如图2所示(图中从左至右的荧光强度结果依次对应0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0mol/L)，体系的荧光强度的差值随着离子强度的增大而呈现增大趋势，但增大到一定程序反而有所下降。因此本发明选择pH7.4的含0.8mol/L的NaCl的PBS溶液控制体系的离子强度。

7、第一稀释液中表面活性剂的优化

按照实施例10中步骤(1)-步骤(3)实施，区别在于分别用0.01％v/v、0.02％v/v、0.05％v/v、0.1％v/v、0.5％v/v，1％v/vTween-20的(0.5％体积比)的PBS缓冲液(pH7.4),以此稀释系列标准浓度的喹乙醇标准液和CdTe量子点标记的喹乙醇抗原溶液。

结果如图2所示(图中从左至右的荧光强度结果依次对应0.01％v/v、0.02％v/v、0.05％v/v、0.1％v/v，0.5％v/v，1％v/v)，Tween-20对体系的荧光强度影响较小，选择Tween-20的浓度为常用浓度0.1％v/v。

8、封闭液的优化

按照实施例10中步骤(1)-步骤(3)实施，区别在于封闭液分别为0.1％、0.5％、1％及2％OVA、

结果如图2所示(图中从左至右的荧光强度结果依次对应0.1％、0.5％、1％及2％OVA)，0.5％OVA的封闭液产生的荧光强度最强且较为稳定。

实验例2

1、标准曲线的绘制及实际样品的测定

按照实施例10、11、12实施，在10

CdTe量子点粒径是8nm，I＝8.6286lgC+63.2(I为结合率，C为喹乙醇的浓度)，相关系数为R

CdTe量子点粒径是11nm，I＝8.1143lgC+64.067(I为结合率，C为喹乙醇的浓度)，相关系数为R

CdTe量子点粒径是15nm，I＝5.714lgC+63.33(I为结合率，C为喹乙醇的浓度)，相关系数为R

对所测试的样品进行荧光免疫实验及加标回收实验结果见表5：

表5抗原包被荧光免疫检测畜禽产品中喹乙醇的回收实验

从表中可以看出，当添加的浓度较低时，得到的回收率分在92.2-123％之间，相对标准偏差≤10％，表明回收效果良好，试验方法是可靠的，结果较为满意，能够满足畜禽产品中喹乙醇微量的检测需要。

2、方法的精密度

按照实施例10实施(测试样品中喹乙醇浓度见表6中标准浓度)，通过对多次的批内和批间的重复实验，得到抗体包被荧光免疫分析方法检测喹乙醇的变异系数如表6所示。可知，批间的变异系数相对较高，可能的原因是日间的操作对抗体抗原的反应产生的结合上的差异，而日内的差异则相对较小，所以批内误差相对较低。

表6抗原包被荧光免疫分析法检测喹乙醇的精密度实验结果

3方法的特异性

选择沙丁胺醇、盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、马布特罗、班布特罗、溴布特罗进行抗体的交叉反应实验(将化学结构相近的其他类似物稀释成系列浓度，取代待测物质的标准溶液，按实验方法测定各自的交叉反应率，以此来评价方法的特异性。交叉反应率＝(IC

表7β-受体激动剂的交叉反应率

本发明考察了荧光免疫分析中的诸多因素，最适浓度、包被介质、包被pH值、离子强度、表面活性剂、封闭液对体系荧光强度的影响，优化了体系条件，开展了间接竞争荧光免疫分析方法检测喹乙醇的研究。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。