一种利用CdTe量子点检测氟虫腈的荧光免疫分析方法

摘要

本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种利用CdTe量子点检测氟虫腈的荧光免疫分析方法。本发明提供的一种CdTe量子点标记氟虫腈抗原的方法，包括如下步骤：向氟虫腈抗原溶液中加入EDC和NHS，静置，然后加入CdTe量子点，放置反应；所述CdTe量子点的粒径范围为5‑8nm；经过大量的摸索实验发现，当CdTe量子点的粒径在5‑8nm时，氟虫腈抗原能够较好的覆盖在CdTe量子点的表面，填补了CdTe量子点的表面缺陷，荧光强度出现明显的增强。该CdTe量子点‑氟虫腈抗原的偶合物能够为荧光免疫分析方法提供良好的荧光探针。

说明书

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种利用CdTe量子点检测氟虫腈的荧光免疫分析方法。

背景技术

食品中有毒物质的痕量、快速检测一直是食品质量安全领域的研究热点。毒鸡蛋产生的原因是饲料的原料在生产及贮藏过程中使用氟虫腈杀虫，造成饲料中的氟虫腈超标，通过食物链蓄积在鸡蛋中，带来了重大食品安全危害。氟虫腈，是一种广谱苯基吡唑类新型杀虫剂，对害虫以胃毒作用为主，兼有触杀和一定的内吸作用，在动植物体中可代谢生成毒性与氟虫腈相当或毒性更高的砜化物或亚砜化合物，被列为C类致癌物。虽然氟虫睛已经被禁限用，但由于其对蚜虫、叶蝉、飞虱、鳞翅目幼虫、蝇类和鞘翅目等重要害虫有很高的杀虫活性，所以在种植以及养殖过程中仍然会使用，存在违规现象，2018年德国再次发现荷兰氟虫腈超标的“毒鸡蛋”。畜禽产品蓄积氟虫腈可能的原因是经牧草、饲料或环境中土壤、水源等环节摄入，因此需要可靠的方法来确定氟虫腈及其代谢物在这些基质中的残留。

国内外研究学者开发的方法主要是实验室定量分析方法和现场定性及半定量即时检测两大类。其中实验室定量分析方法主要依靠液相色谱串联质谱法和气相色谱串联质谱法：如利用气相色谱-质谱联用技术对鸡蛋中的氟虫腈及其代谢物残留量进行检测，检测限和定量限为0.2-0.5ng/g、0.5-1ng/g。上述定量方法需经一系列复杂的前处理净化过程，繁琐费时，从样品预处理到得出检测结果至少需要2天时间，同时需要大型专门的仪器设备和专业技术人员操作，一般实验室不能满足配置要求，因此十分有必要开发新的高灵敏的定量分析方法来加强对氟虫腈及其代谢物残留监督。基于此Aparicio和Yin分别开发了胶束电动毛细管色谱法和电化学分析法，同样实现了鸡蛋中氟虫腈的残留检测，其中Yin使用新型纳米材料ZnO@g-C

为此，本发明提出了一种利用CdTe量子点检测氟虫腈的荧光免疫分析方法，填补荧光免疫分析方法检测氟虫腈的空白，为食品安全检测的进一步发展提供了强有力的技术支持。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于提出了一种利用CdTe量子点检测氟虫腈的荧光免疫分析方法。

为此，本发明提供了如下的技术方案：

一种CdTe量子点标记氟虫腈抗原的方法，包括如下步骤：向氟虫腈抗原溶液中加入EDC溶液和NHS溶液，静置，然后加入CdTe量子点溶液，放置反应；所述CdTe量子点的粒径范围为5-8nm。

可选的，取浓度范围为0.1-8.5mg/mL氟虫腈抗原溶液0.1-0.6mL，加入浓度范围为0.02-0.2mol/L的EDC溶液0.02-0.2mL，和加入浓度范围为0.02-0.2mol/L的NHS溶液0.02-0.2mL，室温静置10-30min，然后加入浓度为0.075×10

可选的，取浓度为5.0mg/mL氟虫腈抗原溶液0.4mL，加入浓度0.10mol/L的EDC溶液0.2ml，和加入浓度为0.10mol/L的NHS溶液0.2ml，20℃静置15min，然后加入浓度为0.150×10

可选的，当CdTe量子点粒径是5nm时，CdTe量子点溶液的浓度为0.15×10

可选的，当CdTe量子点粒径是6nm时，CdTe量子点溶液的浓度为0.15×10

可选的，当CdTe量子点粒径是8nm时，CdTe量子点溶液的浓度为0.15×10

所述的方法得到的CdTe量子点标记氟虫腈抗原在检测氟虫腈中的用途。

一种利用CdTe量子点检测氟虫腈的荧光免疫分析方法，包括如下步骤：

包被：将氟虫腈抗体作为包被原，用包被缓冲液稀释包被原得到的包被液，然后包被酶标板、洗涤；

封闭：用封闭液封闭包被后的酶标板，洗涤；

绘制标准曲线：向封闭后的酶标板中加入系列标准浓度的氟虫腈标准溶液和CdTe量子点标记的氟虫腈抗原溶液稀释液进行间接竞争反应，同时设置不添加氟虫腈的对照溶液，洗板，然后检测荧光度值，氟虫腈标准溶液浓度的lg值作为横坐标，以结合率为纵坐标，绘制标准曲线；所述CdTe量子点标记的氟虫腈抗原溶液为权利要求1-2任一项所述的方法标记得到；所述结合率＝氟虫腈标准溶液的荧光度值/不添加氟虫腈的对照溶液的荧光度值×100％；

测定：向封闭后的酶标板中加入待测样品和CdTe量子点标记的氟虫腈抗原溶液稀释液进行间接竞争反应，洗板，然后检测荧光度值，计算待测样品的结合率，将所得结合率代入所述标准曲线计算得到待测样品的浓度。

可选的，所述包被缓冲液为0.005-0.05mol/L的pH7.0-7.8的PBS、0.01-0.06mol/L的pH8.4-9.6的CBS、0.005-0.02mol/L的pH7.0-9.6的Tris-HCl或0.005-0.02mol/L的pH7.0-9.6的PBST；

可选的，所述包被缓冲液为0.05mol/L的pH7.4的PBS、0.01mol/L的pH9.6的CBS、0.01mol/L的pH8.0的Tris-HCl或0.0lmol/L的pH7.4的PBST；

可选的，所述包被缓冲液为0.05mol/L的pH7.4的PBS；

可选的，将氟虫腈抗体作为包被原，用包被缓冲液稀释包被原至浓度为2-10μg/ml，得到包被液，然后按照50-100微升/孔加入酶标板，0-8℃下包被3-12小时，洗涤。

可选的，所述封闭液为0.1-2％v/v的OVA；

可选的，所述封闭液为0.1％v/v、0.5％v/v、1％v/v或2％v/v的OVA；

可选的，所述封闭液为0.5％v/v的OVA；

可选的，将封闭液按照50-100微升/孔加入包被后的酶标板中，封闭的温度0-8℃，封闭的时间为24-48小时。

可选的，所述绘制标准曲线步骤中，系列标准浓度的氟虫腈标准溶液和CdTe量子点标记的氟虫腈抗原溶液稀释液采用第一稀释液稀释得到，所述系列标准浓度的氟虫腈标准溶液浓度范围为10

可选的，在封闭后的酶标板中，按照20-100微升/孔加入系列标准浓度的氟虫腈标准溶液和按照20-100微升/孔加入稀释的CdTe量子点标记的氟虫腈抗原溶液，调pH7.4，于37℃下反应至少60min；

可选的，向封闭后的酶标板中，按照50微升/孔加入系列标准浓度的氟虫腈标准溶液和按照75微升/孔加入稀释的CdTe量子点标记的氟虫腈抗原溶液，调pH7.4，于37℃下反应至少60min，洗板，用荧光酶标仪检测激发波长365nm和发射波长650nm下的荧光度值；

当CdTe纳米粒径是5nm时，氟虫腈包被抗体浓度为3μg/mL，CdTe量子点标记的氟虫腈抗原溶液稀释4体积倍；

当CdTe纳米粒径是6nm时，氟虫腈包被抗体浓度为2μg/mL,CdTe量子点标记的氟虫腈抗原溶液稀释16体积倍；

当CdTe纳米粒径是8nm时，氟虫腈包被抗体浓度为5μg/mL,CdTe量子点标记的氟虫腈抗原溶液稀释8体积倍。

一种利用CdTe量子点检测氟虫腈的荧光免疫分析试剂盒，包括如下独立包装的试剂：

CdTe量子点标记的氟虫腈抗原溶液：权利要求1-2任一项所述的方法标记得到；

第一稀释液：为含有0.06％v/v的Tween-20，0.2mol/L的NaCl，0.5％v/v的PBS缓冲液，pH为7.4；

系列标准浓度的氟虫腈标准溶液：用第一稀释液稀释得到的10

封闭液：0.1-2％v/v的OVA；

包被缓冲液：0.005-0.05mol/L的pH7.0-7.8的PBS、0.01-0.06mol/L的pH8.4-9.6的CBS、0.005-0.02mol/L的pH7.0-9.6的Tris-HCl或0.005-0.02mol/L的pH7.0-9.6的PBST。

所述的方法标记得到的CdTe量子点标记的氟虫腈抗原溶液、所述的利用CdTe量子点检测氟虫腈的荧光免疫分析方法或所述的利用CdTe量子点检测氟虫腈的荧光免疫分析试剂盒在检测氟虫腈中的用途；

可选的，在检测畜类产品或禽类产品中氟虫腈的用途；

可选的，在检测禽类蛋产品中氟虫腈的用途。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的一种CdTe量子点标记氟虫腈抗原的方法，包括如下步骤：向氟虫腈抗原溶液中加入EDC和NHS，静置，然后加入CdTe量子点，放置反应；所述CdTe量子点的粒径范围为5-8nm；经过大量的摸索实验发现，当CdTe量子点的粒径在5-8nm时，氟虫腈抗原能够较好的覆盖在CdTe量子点的表面，填补了CdTe量子点的表面缺陷，荧光强度出现明显的增强。该CdTe量子点-氟虫腈抗原的偶合物能够为荧光免疫分析方法提供良好的荧光探针。

2.本发明提供的一种利用CdTe量子点检测氟虫腈的荧光免疫分析方法，通过利用上述不同粒径的CdTe量子点标记氟虫腈抗原进行荧光免疫检测氟虫腈，具有检测时间短(10min读出检测结果)、灵敏度高、假阳性低的优势。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实验例1中CdTe量子点标记氟虫腈抗原的体系荧光强度与试剂稀释比的关系；

图2是本发明实验例1中间接竞争FIA分析方法的条件优化。

图3是本发明实验例2中的标准曲线。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

下述实施例中涉及的仪器和试剂：多功能酶标仪(SpectraMax i3x，美国MD公司)；F-7000型荧光分光光度计(日立公司)；U3900型紫外可见分光光度计(日立公司)；pHS-3C酸度计(上海雷磁公司)；GZX-9240MBE电热恒温干燥箱(上海博迅实业有限公司)；79-1加热磁力搅拌器(上海浦东物理光学仪器厂)；碲粉(Te99.999％,中国医药上海化学试剂公司)；氯化镉(分析纯，中国医药上海化学试剂公司)；硼氢化钠(96％，中国医药上海化学试剂公司)；巯基乙酸(分析纯，中国医药上海化学试剂公司)；氢氧化钠(分析纯，中国医药上海化学试剂公司)；罗丹明6G(分析纯，阿拉丁试剂)；实验用水由Milli-Q水处理系统(Millipore)制的。氟虫腈标准品(sigma公司)，氟虫腈抗体(6.6mg/mL)，氟虫腈抗原(8.5mg/mL)均购置北京维德维康生物技术有限公司。EDC的中文名称为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，NHS的中文名称为N-羟基磺基琥珀酰亚胺，OVA的中文名称为卵清蛋白。

CdTe量子点的制备参照“以巯基乙酸为稳定剂的水溶性CdTe量子点的水热合成及表征”[J].人工晶体学报,2015,(02):551-557.张金艳,邱素艳,魏益华,袁丽娟,罗林广等。

下述实施例中的待测样品为鸡蛋样品(一个鸡蛋打碎混匀)1g，加入乙腈(色谱纯，体积5mL)进行溶解处理，过滤离心(高速离心5min，转速设置20000转/min)，取上清，供检测用。

实施例1CdTe量子点标记氟虫腈抗原的方法

取浓度为5mg/mL氟虫腈抗原稀释液0.4mL，加入0.10mol/L的EDC溶液0.2mL，和0.10mol/L的NHS溶液0.2mL，室温(20℃)静置15min，加入0.150×10

实施例2CdTe量子点标记氟虫腈抗原的方法

取浓度为2mg/mL氟虫腈抗原稀释液0.1mL，加入0.04mol/L的EDC溶液0.04mL，和0.04mol/L的NHS溶液0.04mL，室温(25℃)静置30min，加入浓度为0.15×10

实施例3 CdTe量子点标记氟虫腈抗原的方法

取浓度为2mg/mL氟虫腈抗原稀释液0.15mL，加入0.08mol/L的EDC溶液0.04mL和0.08mol/L的NHS溶液0.04mL，室温(25℃)静置10min，加入浓度为0.15×10

实施例4CdTe量子点标记氟虫腈抗原的方法

取浓度为4mg/mL氟虫腈抗原溶液0.1ml，加入0.08mol/L的EDC溶液0.02mL和0.08mol/L的NHS溶液0.02mL，室温(25℃)静置25min，加入浓度为0.15×10

实施例5利用CdTe量子点检测氟虫腈的荧光免疫分析试剂盒

本实施例的利用CdTe量子点检测氟虫腈的荧光免疫分析试剂盒，包括：

CdTe量子点标记的氟虫腈抗原溶液：实施例1所述的方法标记得到；

第一稀释液：为含有0.06％v/v的Tween-20，0.2mol/L的NaCl，0.5％v/v的PBS缓冲液，pH为7.4；

系列标准浓度的氟虫腈标准溶液：用第一稀释液稀释得到的10

封闭液：0.1％v/v的OVA；

包被缓冲液：0.0lmol/L的pH7.4的PBST缓冲液。

实施例6利用CdTe量子点检测氟虫腈的荧光免疫分析试剂盒

本实施例的利用CdTe量子点检测氟虫腈的荧光免疫分析试剂盒，包括：

CdTe量子点标记的氟虫腈抗原溶液：实施例2所述的方法标记得到；

第一稀释液：为含有0.06％v/v的Tween-20，0.2mol/L的NaCl，0.5％v/v的PBS缓冲液，pH为7.4；

系列标准浓度的氟虫腈标准溶液：用第一稀释液稀释得到的10

封闭液：2％v/v的OVA；

包被缓冲液：0.01mol/L的pH8.0的Tris-HCl缓冲液。

实施例7利用CdTe量子点检测氟虫腈的荧光免疫分析试剂盒

本实施例的利用CdTe量子点检测氟虫腈的荧光免疫分析试剂盒，包括：

CdTe量子点标记的氟虫腈抗原溶液：实施例3所述的方法标记得到；

第一稀释液：为含有0.06％v/v的Tween-20，0.2mol/L的NaCl，0.5％v/v的PBS缓冲液，pH为7.4；

系列标准浓度的氟虫腈标准溶液：用第一稀释液稀释得到的10

封闭液：1％v/v的OVA；

包被缓冲液：0.01mol/L的pH9.6的CBS。

实施例8利用CdTe量子点检测氟虫腈的荧光免疫分析试剂盒

本实施例的利用CdTe量子点检测氟虫腈的荧光免疫分析试剂盒，包括：

CdTe量子点标记的氟虫腈抗原溶液：实施例4所述的方法标记得到；

第一稀释液：为含有0.06％v/v的Tween-20，0.2mol/L的NaCl，0.5％v/v的PBS缓冲液，pH为7.4；

系列标准浓度的氟虫腈标准溶液：用第一稀释液稀释得到的10

封闭液：0.5％v/v的OVA；

包被缓冲液：0.05mol/L的pH7.4的PBS。

实施例9利用CdTe量子点检测氟虫腈的荧光免疫分析方法

本实施例采用实施例5的试剂盒提供了一种利用CdTe量子点检测氟虫腈的荧光免疫分析方法，包括如下步骤：

(1)包被：

氟虫腈抗体采用包被缓冲液稀释至氟虫腈抗体浓度为5.0μg/ml，得到包被液，然后在酶标板的每孔中加50微升包被液，4℃包被过夜(10个小时)，然后用pH7.4的PBS溶液洗涤3次；

(2)封闭：

按照50微升/孔加封闭液至包被后的酶标板中，封闭温度为4℃，封闭时间为48小时，然后用pH7.4的PBS溶液洗涤3次；

(3)绘制标准曲线：

向封闭后的酶标板中加入(按照50微升/孔)系列标准浓度的氟虫腈标准溶液(浓度依次为10

所述结合率＝氟虫腈标准溶液的荧光度值/不添加氟虫腈的对照溶液的荧光度值×100％；

(4)测定

在封闭后的酶标板中，加入待测样品(其加入的体积与前述“(3)绘制标准曲线”中系列标准浓度的氟虫腈标准溶液加入的体积相同)和CdTe量子点标记的氟虫腈抗原溶液稀释液(其稀释倍数和加入的体积均与前述“(3)绘制标准曲线”中的相同)，然后将得到的反应体系用0.1mol/L HCl或0.1mol/L的NaOH调pH值为7.4，37℃反应60min，然后用pH7.4的PBS溶液洗涤3次，用荧光酶标仪检测激发波长365nm和发射波长650nm下荧光强度值，根据上述结合率公式计算待测样品的结合率(结合率＝待测样品的荧光度值/不添加氟虫腈的对照溶液的荧光度值×100％)，将待测样品的结合率代入“(3)绘制标准曲线”中的标准曲线计算得到待测样品的浓度。

实施例10利用CdTe量子点检测氟虫腈的荧光免疫分析方法

本实施例采用实施例6提供了一种利用CdTe量子点检测氟虫腈的荧光免疫分析方法，包括如下步骤：

(1)包被：

氟虫腈抗体采用包被缓冲液稀释至氟虫腈抗体浓度为3.0μg/ml，得到包被液，然后在酶标板的每孔中加100微升包被液，0℃包被3小时，然后用pH7.4的PBS溶液洗涤2次；

(2)封闭：

按照50微升/孔加封闭液至包被后的酶标板中，封闭的温度0℃，封闭的时间为24小时，然后用pH7.4的PBS溶液洗涤2次；

(3)绘制标准曲线：

在封闭后的酶标板中，加入(按照20微升/孔)系列标准浓度的氟虫腈标准溶液(浓度依次为10

所述结合率＝氟虫腈标准溶液的荧光度值/不添加氟虫腈的对照溶液的荧光度值×100％；

(4)测定

在封闭后的酶标板中，加入待测样品(其加入的体积与前述“(3)绘制标准曲线”中系列标准浓度的氟虫腈标准溶液加入的体积相同)和CdTe量子点标记的氟虫腈抗原溶液稀释液(其稀释倍数和加入的体积均与前述“(3)绘制标准曲线”中的相同)，然后将得到的反应体系用0.1mol/L HCl或0.1mol/L的NaOH调pH值为7.4，37℃反应60min，然后用pH7.4的PBS溶液洗涤2次，用荧光酶标仪检测激发波长365nm和发射波长650nm下荧光强度值，根据上述结合率公式计算待测样品的结合率(结合率＝待测样品的荧光度值/不添加氟虫腈的对照溶液的荧光度值×100％)，将待测样品的结合率代入“(3)绘制标准曲线”中的标准曲线计算得到待测样品的浓度。

实施例11利用CdTe量子点检测氟虫腈的荧光免疫分析方法

本实施例采用实施例7的试剂盒提供了一种利用CdTe量子点检测氟虫腈的荧光免疫分析方法，包括如下步骤：

(1)包被：

氟虫腈抗体采用包被缓冲液稀释至氟虫腈抗体浓度为2.0μg/ml，得到包被液，然后在酶标板的每孔中加80微升包被液，8℃包被12小时，然后用pH7.4的PBS溶液洗涤3次；

(2)封闭：

按照80微升/孔加封闭液至包被后的酶标板中，封闭的温度8℃，封闭的时间为48小时，然后用pH7.4的PBS溶液洗涤1次；

(3)绘制标准曲线：

向封闭后的酶标板中加入系列标准浓度的氟虫腈标准溶液(浓度依次为10

所述结合率＝氟虫腈标准溶液的荧光度值/不添加氟虫腈的对照溶液的荧光度值×100％；

(4)测定

在封闭后的酶标板中，加入待测样品(其加入的体积与前述“(3)绘制标准曲线”中系列标准浓度的氟虫腈标准溶液加入的体积相同)和CdTe量子点标记的氟虫腈抗原溶液稀释液(其稀释倍数和加入的体积均与前述“(3)绘制标准曲线”中的相同)，然后将得到的反应体系用0.1mol/L HCl或0.1mol/L的NaOH调pH值为7.4，37℃反应60min，然后用pH7.4的PBS溶液洗涤1次，用荧光酶标仪检测激发波长365nm和发射波长650nm下荧光强度值，根据上述结合率公式计算待测样品的结合率(结合率＝待测样品的荧光度值/不添加氟虫腈的对照溶液的荧光度值×100％)，将待测样品的结合率代入“(3)绘制标准曲线”中的标准曲线计算得到待测样品的浓度。

实施例12利用CdTe量子点检测氟虫腈的荧光免疫分析方法

本实施例采用实施例8的试剂盒提供了一种利用CdTe量子点检测氟虫腈的荧光免疫分析方法，包括如下步骤：

(1)包被：

氟虫腈抗体采用包被缓冲液稀释至氟虫腈抗体浓度为5.0μg/ml，得到包被液，然后在酶标板的每孔中加50微升包被液，8℃包被8小时，然后用pH7.4的PBS溶液洗涤3次；

(2)封闭：

按照50微升/孔加封闭液至包被后的酶标板中，封闭的温度8℃，封闭的时间为48小时，然后用pH7.4的PBS溶液洗涤1次；

(3)绘制标准曲线：

向封闭后的酶标板中加入系列标准浓度的氟虫腈标准溶液(浓度依次为10

所述结合率＝氟虫腈标准溶液的荧光度值/不添加氟虫腈的对照溶液的荧光度值×100％；

(4)测定

在封闭后的酶标板中，加入待测样品(其加入的体积与前述“(3)绘制标准曲线”中系列标准浓度的氟虫腈标准溶液加入的体积相同)和CdTe量子点标记的氟虫腈抗原溶液稀释液(其稀释倍数和加入的体积均与前述“(3)绘制标准曲线”中的相同)，然后将得到的反应体系用0.1mol/L HCl或0.1mol/L的NaOH调pH值为7.4，37℃反应60min，然后用pH7.4的PBS溶液洗涤3次，用荧光酶标仪检测激发波长365nm和发射波长650nm下荧光强度值，根据上述结合率公式计算待测样品的结合率(结合率＝待测样品的荧光度值/不添加氟虫腈的对照溶液的荧光度值×100％)，将待测样品的结合率代入“(3)绘制标准曲线”中的标准曲线计算得到待测样品的浓度。

实验例1

1、量子点标记抗原的性能鉴定

CdTe量子点标记的氟虫腈抗原一般采用F/P的比值来鉴定其性能。F/P比值代表CdTe量子点和氟虫腈抗原的结合比率。按照实施例1的步骤实施，原料的浓度和体积(包括CdTe量子点的粒径)按照下表1选择，将制备的CdTe量子点标记氟虫腈抗原用紫外分光光度计分别测定280nm(蛋白质的特异吸收峰)和450nm(标记CdTe量子点的特异吸收峰)的荧光度值。F/P值位于1-5之间方便建立荧光免疫分析方法。按如下公式计算F/P值。

实验结果：

本实验进行了大量的摸索，实验发现，不同配比的CdTe量子点、氟虫腈抗原、EDC、NHS的使用量，氟虫腈抗原包覆在不同粒径的CdTe量子点的表面不同，具体结果如下表1。当CdTe量子点粒径是5nm时，CdTe量子点溶液的浓度为0.15×10

选择最优的复合物颜色为澄清透明的黄色液体，而且没有沉淀浑浊现象出现，F/P值稳定，4℃冷藏三周，荧光强度值和最大发射峰位变化不大，将CdTe量子点标记氟虫腈抗原溶液逐级稀释(采用pH7.4的PBS缓冲液稀释，稀释比为体积比)后测其荧光强度，其荧光强度和该偶联物(CdTe量子点标记氟虫腈抗原)的浓度具有良好的线性关系，如图1所示，线性方程为Y＝3723.2X-3.6216，线性范围是1︰2.5-1︰96，相关系数R

表1

2、CdTe量子点标记抗原与氟虫腈抗体最佳工作浓度的选择。

选择获得较大荧光度值的CdTe量子点标记抗原与氟虫腈抗体浓度为间接竞争荧光免疫分析方法的最佳工作浓度，按照实施例9的方法实施，区别在于采用下述表格2-4中的CdTe量子点标记抗原(CdTe-Fip)(包括CdTe量子点粒径和稀释度选择)与氟虫腈抗体(Fip-ab)的浓度，检测的荧光度值见下表格2-4中。

结果发现：

CdTe粒径是5nm时，氟虫腈抗体的最佳工作浓度为3μg/mL，CdTe标记抗原最佳稀释度1∶4(稀释4体积倍)；当CdTe粒径是6nm时，氟虫腈抗体的最佳浓度为2μg/mL，CdTe标记抗原最佳稀释度1∶16(稀释16体积倍)；当CdTe粒径是8nm时，氟虫腈抗体的最佳工作浓度为5μg/mL，CdTe标记抗原稀释度1∶8(稀释8体积倍)。

表2 氟虫腈抗体与标记抗原最佳工作浓度的选择(5nm)

表3 氟虫腈抗体与标记抗原最佳工作浓度的选择(6nm)

表4 氟虫腈抗体与标记抗原最佳工作浓度的选择(8nm)

3、包被介质的影响

按照实施例9中步骤(1)-步骤(3)实施，区别在于分别以0.05mol/L的pH7.4的PBS、0.01mol/L的pH9.6的CBS、0.01mol/L的pH8.0的Tris-HCl和0.0lmol/L的pH7.4的PBST稀释包被原。

实验结果，实验发现，0.05mol/L的pH7.4的PBS作为包被稀释液，所测得荧光强度较高，且同时该组的线性关系最好。0.01mol/L的pH9.6的CBS、0.01mol/L的pH8.0的Tris-HCl和0.0lmol/L的pH7.4的PBST稀释包被原反应效果分别次之。

4、抗原包被时间优化

按照实施例9步骤(1)-步骤(3)实施，区别在于在4℃条件下氟虫腈抗原包被时间分别选择3h，5h，8h，10h，12h。

实验结果如图2所示(图中从左至右的荧光强度结果依次对应3h，5h，8h，10h，12h)，荧光强度从3h-8h，出现逐渐增强现象，而后趋于稳定。包被时间在10h即可达到最大，因此为了方便安排实验，本发明选择4℃包被过夜。

5、反应时间的优化

按照实施例9步骤(1)-步骤(3)实施，区别在于步骤(3)中37℃下分别反应30min、40min、60min、90min、180min。

实验结果如图2所示(图中从左至右的荧光强度结果依次对应30min、40min、60min、90min、180min)，反应60min的荧光强度最大，随后反应缓慢，荧光强度趋于稳定。60min后再延长反应时间，结合复合物的荧光强度变化不大。故本发明选择免疫反应的时间为60min。

6、pH值的优化

溶液pH值的大小，既影响待测物质的分子结构，也可以影响抗体或抗原的分子结构，从而影响反应的灵敏度，故本实验按照实施例9步骤(1)-步骤(3)实施，区别在于步骤(3)中调节pH值分别为6.5、7.4、7.8。

结果如图2所示(图中从左至右的荧光强度结果依次对应pH6.5、pH7.4、pH7.8)，体系在中性和弱碱性环境中的荧光强度差值较大，小于6.5或大于8.0荧光强度差值均较小，故本发明选择pH＝7.4。

7、PBS缓冲液中离子强度的优化

按照实施例9步骤(1)-步骤(3)实施，区别在于步骤(3)中，所使用的系列标准浓度的氟虫腈标准溶液和CdTe量子点标记的氟虫腈抗原溶液稀释液在配制过程中使用的第一稀释液，第一稀释液分别选择使用含有0.05、0.1、0.2、0.4、0.8mol/L的NaCl的PBS缓冲溶液(pH7.4)。

结果如图2所示(图中从左至右的荧光强度结果依次对应0.05、0.1、0.2、0.4、0.8mol/L)，体系的荧光强度的差值随着离子强度的增大而呈现增大趋势，但增大到一定程度反而有所下降。因此本发明选择pH7.4的含0.2mol/L的NaCl的PBS溶液控制体系的离子强度。

8、表面活性剂的优化

按照实施例9步骤(1)-步骤(3)实施，区别在于步骤(3)中，所使用的系列标准浓度的氟虫腈标准溶液和CdTe量子点标记的氟虫腈抗原溶液稀释液在配制过程中使用的第一稀释液，第一稀释液分别选择使用含有0.02％v/v、0.04％v/v、0.06％v/v、0.08％v/v的Tween-20，0.5％v/v的PBS缓冲液，pH7.4。

结果如图2所示(图中从左至右的荧光强度结果依次对应0.02％v/v、0.04％v/v、0.06％v/v、0.08％v/v)，Tween-20对体系的荧光强度影响较小，选择Tween-20的浓度为常用浓度0.06％v/v。

9、封闭液的优化

按照实施例9步骤(1)-步骤(3)实施，区别在于封闭液分别为0.1％v/v、0.5％v/v、1％v/v及2％v/v的OVA。

结果发现，0.5％v/v的OVA的封闭液产生的荧光强度最强且较为稳定。

实验例2

1、标准曲线的绘制及实际样品的测定

分别按照实施例10、11、12实施，在系列标准浓度的氟虫腈标准溶液10

CdTe量子点粒径是5nm时，I＝8.4857lgC+89.02(I为结合率，C为氟虫腈的浓度)，相关系数为R

CdTe量子点粒径是6nm时，I＝9.8857lgC+88.15(I为结合率，C为氟虫腈的浓度)，相关系数为R

CdTe量子点粒径是8nm时，I＝10.686lgC+86.086(I为结合率，C为氟虫腈的浓度)，相关系数为R

对所测试的样品进行荧光免疫实验及加标回收实验结果见下表：

表5 抗原包被荧光免疫检测禽蛋产品中氟虫腈的回收实验

从表中可以看出，当添加的浓度较低时，得到的回收率分在89-128％之间，相对标准偏差≤9.1，表明回收效果良好，试验方法是可靠的，结果较为满意，能够满足畜禽产品中氟虫腈微量的检测需要。

2、方法的精密度

按照实施例9实施(测试样品中氟虫腈浓度见表6中标准浓度)，通过对多次的批内和批间的重复实验，得到本发明方法检测氟虫腈的变异系数如表6所示。可知，批间的变异系数相对较高，可能的原因是日间的操作对抗体抗原的反应产生的结合上的差异，而日内的差异则相对较小，所以批内误差相对较低。

表6检测氟虫腈的精密度实验结果

3方法的特异性

选择乙虫腈、丁烯氟虫腈、氟虫腈砜、氟虫腈酰胺抗体的交叉反应实验。将化学结构相近的其他类似物稀释成系列浓度，取代待测物质的标准溶液，按实施例9实施，然后计算各自的交叉反应率，以此来评价方法的特异性。交叉反应率＝(IC

表7结构相似杀虫剂的交叉反应率

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。