一种负载Olig2信使RNA的脂质纳米颗粒及其应用

摘要

本发明涉及一种负载Olig2信使RNA的脂质纳米颗粒，涉及脂质纳米颗粒技术领域。该脂质纳米颗粒包括负载Olig2的信使RNA，所述脂质纳米颗粒修饰了CD140a单克隆抗体，所述脂质纳米颗粒将所述信使RNA递送至细胞膜表面表达CD140a的OPCs。上述脂质纳米颗粒能使OPCs瞬时过表达Olig2，提高脑内驻留的OPCs的分化成熟及成髓鞘能力，可有效提高缺血性脑卒中的治疗效果。

说明书

技术领域

本发明涉及脂质纳米颗粒技术领域，特别是涉及一种负载Olig2信使RNA的脂质纳米颗粒及其应用。

背景技术

缺血性脑卒中(Ischemic stroke)是世界上最普遍的一种心脑血管疾病，主要是由脑部系统血液循环突然堵塞或短时间血流缓慢所引起的一系列突发性局部中枢神经功能丧失。脑组织供血和供氧的不足会导致中枢神经系统中少突胶质细胞死亡，进而引起髓鞘崩解。髓鞘是中枢神经系统中白质的主要组成部分，在大脑不同区域之间的神经信号传递和信息沟通中起着重要的作用。尽管以往缺血性脑卒中的病理研究多是聚焦在灰质神经元的死亡，但是脑白质中髓鞘的重要性在缺血性脑卒中长期恢复的作用越来越得到重视。而内源性少突胶质细胞祖细胞(Oligodendrocyte progenitor cells,OPCs)是脑卒中后白质髓鞘损伤的主要治疗靶点。在脑卒中早期阶段，脑内梗死区域周围驻留OPCs能够迁移到缺血部位，增殖并分化为少突胶质细胞，部分弥补有髓鞘少突胶质细胞的不足。然而，这种驻留的OPC分化为成熟少突胶质细胞和促进髓鞘形成的能力是显然不足的。为此，招募这些驻留的OPCs并提高其分化成熟和成髓鞘能力是治疗缺血性脑卒中一大治疗策略。

以往的研究已经证实，转录因子Olig2在少突胶质细胞形成和髓鞘再生中发挥了重要的作用。在一项小鼠实验中，通过激活脑内PDGFRa+/CD140a阳性OPCs的Olig2的表达，可以诱导少突胶质细胞的快速分化成熟，并促进胼胝体中受损髓鞘的再生。因此，Olig2可能是促进在缺血性脑卒中髓鞘再生中的一个重要治疗靶点。

近年来，信使RNA(massager RNA，mRNA)介导的蛋白质高效表达引起了学术界和工业界的高度关注。不断有研究表明，mRNA不仅具有更高效的转染效率和更高的蛋白表达水平，而且与病毒介导的DNA修饰相比具有更大的安全优势。有效的体内传递对于mRNA翻译成蛋白至关重要。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供一种负载Olig2信使RNA的脂质纳米颗粒，该脂质纳米颗粒使OPCs瞬时过表达Olig2，提高脑内驻留的OPCs的分化成熟及成髓鞘能力，可有效提高缺血性脑卒中的治疗效果。

为了达到上述目的，本发明提供了一种负载Olig2信使RNA的脂质纳米颗粒，该脂质纳米颗粒包括负载Olig2的信使RNA，所述脂质纳米颗粒修饰了CD140a单克隆抗体，所述脂质纳米颗粒将所述信使RNA递送至细胞膜表面表达CD140a的OPCs。

本发明人在研究过程中发现脂质纳米颗粒(LNPs)通常由阳离子/离子化脂质和辅助脂质(如磷脂、胆固醇和/或聚乙二醇脂质)组成，而核酸药物与普通化学药物的显著区别在于核酸具有大量的负电磷酸根，因而核酸药物可以很容易地被阳离子脂质LNPs吸附而包裹。当负载核酸的LNPs进入细胞后，在酸性的环境下，阳离子脂类物质可以电离，实现核酸药物的细胞内释放。所以，本发明人构建了一个负载Olig2信使RNA的脂质纳米颗粒，利用阳离子脂质体，该脂质纳米颗粒将负载Olig2信使RNA递送至OPCs，使OPCs瞬时过表达Olig2。通过颅内注射的方式，将该脂质纳米颗粒注射到缺血性脑卒中小鼠大脑内，Olig2-LNPs引起内源性OPCs的分化成熟为MBP阳性的少突胶质细胞和髓鞘形成，并最终显著改善脑卒中小鼠学习和记忆功能缺陷。相比于传统的药物溶栓治疗，本策略能够有效地改善缺血性脑卒中长期的学习和记忆能力的障碍，促进神经功能恢复；同时相比于传统的病毒介导的蛋白质表达，信使RNA介导的蛋白质表达，具有更高效的表达水平、明显的低基因毒性以及更低的治疗风险。同时，采用上述抗体修饰，能使脂质纳米颗粒在脑内靶向于CD140a

在其中一个实施例中，所述脂质纳米颗粒包括脂质相和溶液相，所述脂质相包括以下摩尔比的原料：

所述溶液相由以下原料制备得到：负载Olig2的信使RNA溶液相柠檬酸缓冲溶液，所述柠檬酸缓冲溶液包括体积比为2.5-3.5:1的水和乙醇，所述柠檬酸缓冲溶液的pH值为3.8-4.2，所述负载Olig2信使RNA和所述DLink-MC3-DMA的摩尔比为1：8-12。

采用上述摩尔比的原料制备得到的脂质相和溶液相，包封率高，接近98％。

本发明还提供了所述脂质纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

制备脂质相：将DLink-MC3-DMA、DSPC、胆固醇、DMG-PEG2000混合，溶解，得到脂质相；

制备溶液相：制备负载Olig2信使RNA，将所述负载Olig2信使RNA溶解于柠檬酸缓冲溶液，得到溶液相；

制备第一脂质纳米颗粒：将所述脂质相和所述溶液相采用微流控技术混合，形成纳米颗粒溶液，进行第一透析，得到第一脂质纳米颗粒；

抗体修饰：采用碳二亚胺盐EDC和CD140a单克隆抗体进行第一孵育，再将CD140a单克隆抗体与DSPE-PEG-NH2进行第二孵育，进行第二透析，得到抗体偶联物，将所述抗体偶联物和所述第一脂质纳米颗粒进行第三孵育，得到负载Olig2信使RNA的脂质纳米颗粒。

采用上述制备方法，能使阳离子脂质体和Olig2 mRNA通过微流控装置，形成负载Olig2信使RNA的脂质纳米颗粒，制备得到的脂质纳米颗粒的粒径在155nm左右，工艺稳定，可控性和重现性好，易于工业化生产。

在其中一个实施例中，所述制备第一脂质纳米颗粒步骤中，所述第一透析采用透析袋进行，所述透析袋的分子量为2800-3200，所述第一透析的时间为20-30h。

在其中一个实施例中，所述抗体修饰步骤中，所述碳二亚胺盐EDC的浓度为0.05-0.15mg/mL，所述活化的pH值为6-7，所述DSPE-PEG-NH2与所述CD140a单克隆抗体的摩尔比为8-12：1。

采用上述反应条件，能够最大限度地活化所需的单克隆抗体。

在其中一个实施例中，所述抗体修饰步骤中，所述第一孵育的孵育温度为22-27℃，所述第一孵育的孵育时间为25-35min；所述第二孵育的孵育时间为3-5小时，所述第二孵育的pH值为7-8，所述第二透析采用截留分子量为80-120KD的透析膜。

采用上述反应条件，能够较好地实现单克隆抗体的偶联。

在其中一个实施例中，所述抗体修饰步骤中，所述第三孵育的孵育温度为45-55℃，所述第三孵育的孵育时间为15-25min。

本发明还提供了一种药物组合物，该药物组合物包括所述脂质纳米颗粒以及药学上可接受的辅料。

本发明还提供了所述脂质纳米颗粒在制备预防或治疗心脑血管疾病的药物中的应用。

在其中一个实施例中，所述心脑血管疾病为缺血性脑卒中。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的一种负载Olig2信使RNA的脂质纳米颗粒及其应用，该脂质纳米颗粒将负载Olig2信使RNA递送至OPCs，使OPCs瞬时过表达Olig2，同时，利用单克隆抗体CD140a修饰的LNPs能够有效地将Olig2 mRNA靶向递送至目的细胞CD140a

附图说明

图1为实施例1中合成靶向抗体修饰的Olig2脂质纳米粒示意图。

图2为实施例1中透射电镜观察抗体修饰的Olig2脂质纳米粒的结果图(比例尺100nm)。

图3为实施例1的I-Olig2和C-Olig2琼脂糖凝胶电泳图。

图4为实施例1的I-Olig2和C-Olig2包封率结果图。

图5为实施例2中流式检测不同浓度的C-Olig2在OPCs体外转染效率的结果图。

图6为实施例3中流式分选小鼠脑内CD140a

图7为实施例3中Western blot分析小鼠脑内CD140a

图8为实施例4中神经功能缺陷评分结果图。

图9为实施例4中组织免疫荧光检测单次注射C-Olig2对小鼠海马区MBP阳性少突胶质细胞数量的影响的结果图；其中，图9A为免疫荧光检测小鼠海马MBP的表达的结果图(比例尺100μm)，图9B为MBP表达的定量统计结果图(*p<0.05,##p<0.01)。

图10为实施例4中单次C-Olig2颅内注射对小鼠海马区髓鞘形成的作用的结果图，其中，图10A为透射电镜检测成髓鞘的轴突，图10B为成髓鞘轴突的定量统计(*p<0.05,###p<0.001)。

图11为实施例4中单次C-Olig2颅内注射对改善MCAO小鼠的学习记忆功能的作用的结果图，其中，图11A为水迷宫实验示意图；图11B为撤掉平台后，小鼠第一次寻找到平台区域的潜伏期(*p<0.05,##p<0.01)；图11C为在60s时间内，小鼠在平台所处象限的时间的百分比(*p<0.05,##p<0.01)；图11D的上排：各组小鼠训练时代表性轨迹图，下排：各组小鼠测试时代表性轨迹图。

其中，I-Olig2为修饰对照抗体IgG Olig2 mRNA/LNPs，C-Olig2为修饰靶向抗体CD140a Olig2 mRNA/LNPs。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

定义：

DLink-MC3-DMA：指一种新型阳离子脂质，化学名为4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-庚三十碳-6,9,28,31-四稀-19-基脂，分子式C

DSPC：指1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱。

DMG-PEG2000：指1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000。

碳二亚胺盐EDC：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐。

DSPE-PEG-NH2：指二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺PEG胺。

来源：

抗CD140a小鼠单克隆抗体(135902，BioLegend公司)，DLink-MC3-DMA(上海舜纳生物科技有限公司，纯度98％)，DSPC、胆固醇、DSPE-PEG2000、碳二亚胺盐EDC、DSPE-PEG-NH2(均购自德国Lipoid公司)。

本实施例所用试剂、材料、设备如无特殊说明，均为市售来源；实验方法如无特殊说明，均为本领域的常规实验方法。

实施例1

负载Olig2 mRNA靶向抗体修饰的阳离子脂质纳米粒的制备和表征。

1、Olig2 mRNA靶向抗体修饰的LNPs的制备。

制备流程如图1所示。

(1)参照申请号202110566034.7的专利构建表达mouse Olig2的质粒，体外转录合成Olig2 mRNA，该负载Olig2信使RNA的序列如SEQ ID NO:1所示。

(2)脂质相DLink-MC3-DMA：DSPC：胆固醇：DMG-PEG2000(摩尔比为55：5：38.5：1.5)溶解在90％乙醇中；与负载Olig2信使RNA溶液相(水和乙醇的体积比＝3：1；柠檬酸调PH＝4)，其中负载Olig2信使RNA与DLink-MC3-DMA摩尔比例为1:10，经Nano Assemblr Benchtop微流控装置注入混合处理，形成100nm左右的纳米颗粒溶液；后采用3000分子量透析袋以DEPC水(pH7.4)透析24小时，制得负载Olig2信使RNA的LNPs。

(3)采用0.1mg/mL浓度碳二亚胺盐EDC和CD140a单克隆抗体，在25℃下孵育30min，PH＝6.5，活化CD140a单克隆抗体的羧基基团，再与CD140a单克隆抗体的10倍摩尔数量的DSPE-PEG-NH2共同孵育4小时(PH＝7.5)，经过100kd透析膜除去未连接的DSPE-PEG-NH2，获得DSPE-PEG-抗体偶联物。在50℃条件下，将偶联物与上述负载Olig2信使RNA的LNPs共同孵育20分钟后，所形成的抗体修饰性mRNA载体(修饰了绿色荧光)，在4℃条件保存备用。

2、检测mRNA/LNPs的粒径与Zeta电位。

室温条件下，以50倍蒸馏水溶解稀释mRNA/LNPs溶液及空白对照，加入石英皿中，通过马尔文激光粒度仪分别检测样品的粒径分布与Zeta电位，结果如下表所示。

表1脂质纳米颗粒的纳米表征

结果显示，修饰对照抗体IgG Olig2 mRNA/LNPs(I-Olig2)平均粒径在107.4nm，Zeta电位在34.8mV；修饰靶向抗体CD140a Olig2 mRNA/LNPs(C-Olig2)平均粒径在157.5nm，Zeta电位在18.2mV。

3、透射电镜(TEM)观测mRNA/LNPs的超微形态。

将两种mRNA/LNPs适量稀释后，吸取10μL液体滴于碳膜的铜网上，干燥并以2％磷钨酸充分浸润负染后，通过TEM下观测纳米粒形态。

结果如图2所示，两种mRNA/LNPs的透射电镜图形态均呈圆形，粒径在100nm左右。

4、测定mRNA/LNPs的包封率。

分别将含1μg(mRNA质量)的mRNA脂质纳米粒与相应mRNA，加至4％(w/v)琼脂糖凝胶上样孔，55V电压条件下电泳60分钟，EB显色，生物电泳图像分析系统观察质粒条带并拍照。如图3所示，发现Olig2 mRNA跑出相应分子量条带，而纳米载体中的mRNA停留与样品孔中(分子量过大而无法移动)，说明mRNA成功稳定负载于脂质纳米载体中，无额外mRNA条带产生，包封率效率95％以上，如图4所示。

实施例2

负载Olig2 mRNA靶向抗体修饰的LNPs对小鼠神经干细胞来源的OPCs体外摄取效果验证。

为了探索不同浓度的Olig2 mRNA/LNPs的转染效果，OPCs按照每孔5x10

实施例3

负载Olig2 mRNA靶向抗体修饰的LNPs在小鼠体内OPCs摄取效果验证。

为了考察Olig2 mRNA/LNPs经颅内注射到小鼠脑内，在CD140a

具体操作如下：

1、大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型小鼠接受(0.05mg kg

2、100uL RIPA裂解分选得到的CD140a

3、加入5x上样缓冲液，100℃变性蛋白5分钟，用10％的聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离样品。依次在上样孔中加入蛋白maker 6uL，CD140a

4、电泳结束后，甲醇活化PVDF膜，取出电泳后的凝胶，剪裁成合适大小后放入转膜缓冲液中平衡。准备转膜夹盒，按照从负极到正极的顺序依次为海绵，滤纸，凝胶，PVDF膜，滤纸和海绵。将装好的转膜夹盒放入槽内，加入转膜缓冲液，同时放入冰盒。在4℃环境下以恒流300mA转膜2小时。

5、转膜结束后，将PVDF膜在封闭液(含有5％的脱脂牛奶，0.05％的tween-20的TBS，)中室温封闭1小时，然后放入稀释后的一抗中，4℃下孵育过夜。第二天，用TBST洗3次，每次5分钟，然后加入辣根过氧化酶标记的二抗室温孵育1小时。用TBST洗3次，每次5分钟，最后化学发光仪显影。结果如图7所示，在接受C-Olig2颅内注射24小时之后，Olig2成功实现了在CD140a

实施例4

C-Olig2颅内注射对MCAO小鼠的治疗效果。

1、MCAO模型小鼠的构建。

小鼠手术前禁食24小鼠，使用麻醉机对小鼠进行异氟烷吸入麻醉(3-4％诱导麻醉，2-2.5％维持麻醉状态，异氟烷流量为0.5-0.7L/分钟)将麻醉好的小鼠仰卧固定在体式显微镜台上，颈正中切口，分离右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)、结扎ICA的重要分支翼腭动脉，结扎CCA，结扎并游离ECA主干一段，用无创动脉夹分别夹闭ICA颅底端，在CCA近ICA分岔处打一活结，并剪出“V”形切口，将线栓顺着CCA的“V”形切口插入，松开ICA上的动脉夹，将线栓顺势通过ICA直至大脑中动脉(MCA)，线栓插入深度为18-20mm(ECA与ICA分岔处为起点)，感觉稍微遇到阻力时停止，使线头端通过MCA起始处，到达较细的大脑前动脉。此时即完成一侧大脑中动脉阻塞(MCAO)，固定线栓，逐层缝合切口。假手术对照组不插入线栓。小鼠脑缺血1小时后，将线栓退至颈外动脉残端，形成再灌注损伤。待手术结束后给予注射用青霉素钠水溶液适量局部涂敷，放入笼中37℃环境下饲养，每日腹腔注射青霉素钠20万U/只，连用3天(如出现小鼠感染的情况下，可延长至1周)。将实验动物分为4组，每组15只，上述4组分别为：假手术(sham)组、模型组(MCAO)、注射C-Olig2、注射I-Olig2。脂质纳米粒注射剂量为0.05mg.kg

2、单次C-Olig2颅内注射对MCAO小鼠神经功能(Menzies)评分的变化。

单次注射Olig2 mRNA/LNP后第21天，对MCAO小鼠进行神经功能缺陷评分。评分标准是采用Menzies：正常无损伤，双肢对称向对面伸展(0)；对侧前肢持续内收(1分)；对侧前肢握力下降(2分)；小鼠受刺激后绕圈转(3分)；小鼠自主性转圈(4分)。结果如图8所示，相比于MCAO模型小鼠，经过脂质纳米粒治疗后的小鼠能够显著降低神经功能缺陷评分，提示神经功能的改善，值得注意的是靶向修饰的C-Olig2展现出更好的神经功能改善作用。

3、单次C-Olig2颅内注射对小鼠海马OPCs分化成熟及髓鞘形成的作用。

MCAO小鼠接受C-Olig2颅内注射，4周后，多聚甲醛和PBS灌注取脑包埋固定。组织免疫荧光检测海马MBP的表达以及透射电镜检测髓鞘超微结构。组织免疫荧光检测单次注射C-Olig2对小鼠海马区MBP阳性少突胶质细胞数量的影响的结果如图9的A-B所示，相比于MCAO模型小鼠，脂质纳米粒的治疗能够从而促进脑内MBP阳性的少突胶质细胞分化形成；并且具有靶向作用的C-Olig2显示出更加明显的促少突胶质细胞形成的效果。此外，透射电镜进一步显示单次单次注射C-Olig2，增加的少突胶质细胞可能进一步引起小鼠海马区髓鞘的再生，表现为成髓鞘轴突的显著性增加(图10的A-B)。综合以上结果显示单次C-Olig2颅内注射能够显著地提升MCAO小鼠海马OPCs分化成熟，最终引起髓鞘的再生。

4、单次C-Olig2颅内注射对改善MCAO小鼠的学习记忆功能的作用。

以往很多研究表明，海马区髓鞘形成在学习和中发挥了重要的作用。已经观察到单次C-Olig2颅内注射引起了小鼠海马OPCs分化成熟及髓鞘再生，接下来进一步研究单次注射C-Olig2后能否改善MCAO小鼠长期的学习和记忆功能的缺陷。脂质纳米粒治疗第21天，Morris水迷宫检测MCAO小鼠的学习和记忆能力(图11A)。采取的检测指标是MCAO小鼠在撤掉平台后第一次进入原平台区域所花的时间以及寻找平台时经过目标平台所在象限时间占测试时间60s的百分比。如图11B所示，相比于MCAO模型小鼠和无靶向的I-Olig2治疗的小鼠，经过靶向的C-Olig2治疗的小鼠在寻找平台过程中具有更少的第一次潜伏期，表明能够更快地记忆和识别原平台所在区域。此外，经过靶向的C-Olig2治疗的小鼠在平台所处象限里时间占比更大(图11C)。代表性的训练和测试路径图如图11D所示。综合以上结果表明，显示单次C-Olig2颅内注射能够显著地改善MCAO小鼠学习和记忆功能的缺陷。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 中山大学•深圳

中山大学

<120> 一种负载Olig2信使RNA的脂质纳米颗粒及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 972

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggactcgg acgccagcct ggtgtccagc cgcccgtcgt cgccagagcc cgatgacctt 60

tttctgccgg cccggagtaa gggcagcagc ggcagcgcct tcactggggg caccgtgtcc 120

tcgtccaccc cgagtgactg cccgccggag ctgagcgccg agctgcgcgg cgctatgggc 180

tctgcgggcg cgcatcctgg ggacaagcta ggaggcagtg gcttcaagtc atcctcgtcc 240

agcacctcgt cgtctacgtc gtcggcggct gcgtcgtcca ccaagaagga caagaagcaa 300

atgacagagc cggagctgca gcagctgcgt ctcaagatca acagccgcga gcgcaagcgc 360

atgcacgacc tcaacatcgc catggatggc ctccgcgagg tcatgccgta cgcacacggc 420

ccttcggtgc gcaagctttc caagatcgcc acgctgctgc tggcgcgcaa ctacatcctc 480

atgctcacca actcgctgga ggagatgaag cgactggtga gcgagatcta cgggggccac 540

cacgctggct tccacccgtc ggcctgcggc ggcctggcgc actccgcgcc cctgcccgcc 600

gccaccgcgc acccggcagc agcagcgcac gccgcacatc accccgcggt gcaccacccc 660

atcctgccgc ccgccgccgc agcggctgct gccgccgctg cagccgcggc tgtgtccagc 720

gcctctctgc ccggatccgg gctgccgtcg gtcggctcca tccgtccacc gcacggccta 780

ctcaagtctc cgtctgctgc cgcggccgcc ccgctggggg gcgggggcgg cggcagtggg 840

gcgagcgggg gcttccagca ctggggcggc atgccctgcc cctgcagcat gtgccaggtg 900

ccgccgccgc accaccacgt gtcggctatg ggcgccggca gcctgccgcg cctcacctcc 960

gacgccaagt ga 972