原发性中枢神经系统淋巴瘤原代细胞的培养方法及专用培养基

摘要

本发明公开了原发性中枢神经系统淋巴瘤(PCNSL)原代细胞的培养方法及专用培养基。所述专用培养基的成分包括：DMEM/F12，神经基础培养基，N2添加剂，B27添加剂，2‑巯基乙醇，人胰岛素，谷氨酰胺，丙酮酸钠，最低基本培养基，表皮细胞生长因子，碱性成纤维细胞生长因子和青霉素‑链霉素。本发明进一步公开了采用该专用培养基获得PCNSL原代细胞的培养方法。采用本发明的PCNSL原代细胞的专用培养基及其培养方法能够得到PCNSL的原代细胞，可用于PCNSL发生发展的机制研究和抗肿瘤药物筛选，同时为后续培养PCNSL细胞系奠定了基础。

说明书

技术领域

本发明涉及肿瘤原代细胞的培养方法，尤其涉及原发性中枢神经系统淋巴瘤原代细胞的培养方法及专用培养基，属于原发性中枢神经系统淋巴瘤原代细胞的体外培养领域。

背景技术

原发性中枢神经系统淋巴瘤(PCNSL)是一种罕见且具有侵袭性的结外非霍奇金淋巴瘤，其发病率占中枢神经系统肿瘤的4％，占结外淋巴瘤的4％-6％。PCNSL病程短，进展快，预后差，具有高度致死性，5年和10年生存率分别为37.6％和29.7％。PCNSL的最佳治疗方案尚未确定，基于高剂量甲氨蝶呤的联合治疗是目前PCNSL的一线治疗方案。尽管一线治疗有较高的缓解率，但仍有50％患者会复发，10-15％的患者为原发耐药，属结外淋巴瘤中预后很差的类型，因此临床亟需新的治疗药物优化一线治疗方案。通过体外培养病人来源的PCNSL细胞，构建PCNSL疾病模型进行临床前药物筛选迫在眉睫。

鉴于PCNSL是一种罕见肿瘤，目前仍然没有原代细胞培养方法的相关报道且无成熟的细胞系，体外PCNSL发生发展的机制研究以及抗肿瘤药物筛选均受到了很大限制。早期PCNSL的基础研究是基于体部非霍奇金淋巴瘤细胞系的异种移植模型，并不能真实还原PCNSL发生发展的历程。随着病人来源的异种移植模型(PDX)技术的发展和进步，近年来PCNSL的基础研究是基于病人来源的PCNSL异种移植模型。虽然PDX技术能很好的应用于抗肿瘤药物筛选，但构建PDX模型周期长，成本高，成功率低。同时，基于手术切除对PCNSL患者无明显生存获益且存在神经损伤后遗症，针对中枢神经系统肿瘤，美国国立综合癌症网络(NCCN)指南不推荐手术切除，导致PCNSL大块组织难以获得，PDX模型构建更加困难。因此，亟需一种容易构建PCNSL疾病模型的方法。

通过特制的培养基体外培养病人来源的PCNSL组织，获得PCNSL原代细胞，建立体外PCNSL疾病模型，可以从细胞分子角度去深入研究疾病发生发展的机制，并且可以有针对性的利用此类细胞进行临床前药物筛选及药效评估。相比于PDX模型，该培养方法培养周期更短，成本更低，技术上更容易实施和普及。

发明内容

本发明的目的之一是提供用于原发性中枢神经系统淋巴瘤原代细胞的专用培养基；

本发明的目的之二是提供原发性中枢神经系统淋巴瘤原代细胞的培养方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明一方面提供了用于原发性中枢神经系统淋巴瘤原代细胞的专用培养基(PCNSL培养基)，所述专用培养基的成分包括：DMEM/F12，神经基础培养基(Neurobasalmedium)，N2添加剂(N2 supplement)，B27添加剂(B27 supplement)，2-巯基乙醇(2-mercaptoethanol)，人胰岛素(Human insulin)，谷氨酰胺(Glutamax)，丙酮酸钠(Sodiumpyruvate)，最低基本培养基(MEM)，表皮细胞生长因子(EGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，青霉素-链霉素(Penicillin-Streptomycin)。

优选的，每50ml的专用培养基中，各成分的体积或其终浓度为：

2-Mercaptoethanol其终浓度为3.5ul/L；

Insulin human recombinant 25ul 5mg/ml，其终浓度为2.5ug/ml；

Glutamax 500ul；

Sodium pyruvate 500ul；

MEM-Non-essential amino acids,250ul；

EGF,100ul 10ug/ml，其终浓度为20ng/ml；

bFGF,100ul 10ug/ml，其终浓度为20ng/ml；

Penicillin-Streptomycin 500ul。

作为参考，终浓度为3.5ul/L的2-Mercaptoethanol的配制方法包括：将2-Mercaptoethanol用DMEM/F12稀释100倍，即990ul DMEM/F12中加入10ul 2-Mercaptoethanol，充分混匀后取出17.5ul加入到培养基中。

作为参考，人胰岛素的配制方法包括：将25mg胰岛素冻干粉用0.01MHCl 5ml溶解成母液浓度为5mg/ml的胰岛素，0.22uM滤膜过滤母液后100ul/管分装，-20℃储存。

作为参考，所述EGF的配制方法包括：0.22uM滤膜过滤0.1％BSA，将100ug EGF加入5mM Tri溶液1ml充分溶解重悬，再用0.1％BSA稀释至浓度为10ug/ml(即0.1％BSA 900ul+100ug/ml EGF 100ul)，分装保存100ul/管，-20℃储存。

作为参考，所述bEGF的配制方法包括：0.22uM滤膜过滤0.1％BSA，将100ug bEGF加入5mM Tri溶液1ml充分溶解重悬，再用0.1％BSA稀释至浓度为10ug/ml(即0.1％BSA 900ul+100ug/ml bEGF 100ul)，分装保存100ul/管，-20℃储存。

本发明的第二方面是提供原发性中枢神经系统淋巴瘤原代细胞的培养方法，包括

(1)将新鲜的原发性中枢神经系统淋巴瘤组织置于DMEM/F12培养基中无菌环境下剪切至组织块；

(2)将步骤(1)得到的组织块悬浮后离心，弃上清，加入PCNSL培养基和基质胶(matrigel，Corning cat.no.356234)充分混匀得到混悬液，每个凹陷性小窝迅速加入20ul混悬液；将装有混悬液的凹陷性小窝置于培养皿中并加入PBS保湿，再放入CO

(3)将固化的包埋有PCNSL组织块的培养基从凹陷性小窝完整剥离置于12孔板中，每孔加入PCNSL培养基进行原代细胞培养；每3～4天进行半换液直至有原代PCNSL细胞从matrigel包埋的小球中溢出；原代PCNSL细胞呈圆形，聚团悬浮生长。

作为本发明一种优选的具体实施方案，步骤(1)中将新鲜的原发性中枢神经系统淋巴瘤组织置于DMEM/F12培养基中无菌环境下剪切至1mm

作为本发明一种优选的具体实施方案，步骤(2)中PCNSL培养基和matrigel按照1:4～1:9的体积比例添加。

本领域技术人员可以按照任何一种方法制备得到能容纳20ul以上的圆形培养体的凹陷性小窝，均能适用于本发明；作为参考，本发明提供了一种方便快捷的制备所述凹陷性小窝的方法，该方法包括：采用封口膜在10ul移液枪枪头盒板上制作12～16个凹陷性小窝。

作为本发明一种优选的具体实施方案，步骤(2)中将装有混悬液的凹陷性小窝置于6cm培养皿中并加入1～2ml PBS保湿，再放入37℃，5％CO

作为本发明一种优选的具体实施方案，步骤(3)中将固化的matrigel包埋的PCNSL组织块从凹陷性小窝完整剥离置于12孔板中，3-4个/孔，每孔加入2ml PCNSL培养基进行培养。

作为本发明一种优选的具体实施方案，步骤(3)中每孔加入PCNSL培养基进行原代细胞培养时每3～4天进行半换液。

作为本发明一种优选的具体实施方案，步骤(3)中从matrigel包埋的小球中溢出的原代PCNSL细胞呈圆形，聚团悬浮生长。

采用本发明的原发性中枢神经系统淋巴瘤原代细胞的专用培养基及其培养方法能够得到PCNSL的原代细胞，可用于PCNSL发生发展的机制研究和抗肿瘤药物筛选，同时为后续培养PCNSL细胞系奠定了基础。

附图说明

图1为制备凹陷性小窝的装置。

图2为matrigel包埋剪碎的PCNSL组织。

图3为两例PCNSL细胞从matrigel包埋的小球中溢出的4倍图(左)10倍图(中间)20倍图(右)。

图4为两例PCNSL细胞标志物CD19，CD20的流式细胞展示图。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1原发性中枢神经系统淋巴瘤原代细胞的培养方法

从一名原发性中枢神经系统淋巴瘤(PCNSL)患者中获取活检组织标本(男，69岁)。

原发性中枢神经系统淋巴瘤原代细胞的原代培养步骤包括：

第一步：使用封口膜在10ul枪头盒板上制作12～16个凹陷性小窝；

具体的，凹陷性小窝制作的步骤如下：(1)准备10ml圆头EP管，0.2ml PCR管，剪刀，镊子，10ul枪头盒板，6×6cm～8×8cm的封口膜；(2)制作组合小工具：用剪刀在10ml圆头EP管的合适部位(尾端)剪一个圆形缺口，大小稍大于PCR管开口，以能卡住0.2ml PCR管为宜；(3)用剪刀将6×6cm～8×8cm的封口膜裁剪成六边形；(4)将制作好的组合小工具、剪刀，镊子，10ul移液枪枪头盒板置于高压锅进行高压消毒；(5)提前将裁剪成八边形的封口膜浸泡于75％的酒精中24h以上；(6)将浸泡好的封口膜在超净工作台中取出待表面酒精挥发，置于10ul枪头盒板上，用镊子将封口膜的边角固定，手持组合小工具的一端，遵守无菌原则，用一定力度在封口膜上下压组合小工具，以出现能容纳20ul以上的圆形培养体的凹陷性小窝为宜；(7)根据PCNSL活检组织量制作12～16个小窝。

其中，可制作20ul以上的圆形培养体的工具组合均适用于本发明的后续步骤。

图1(a,b)，为制备凹陷性小窝的装置，封口膜需要提前置于75％酒精中浸泡消毒，用于制造凹陷性小窝的EP管、镊子、200ul枪头盒板需提前高压锅消毒。

第二步：将新鲜PCNSL组织置于DMEM/F12培养基中，无菌环境下剪切至1mm

具体的，经立体定向活检术取下的新鲜PCNSL组织，放入装有5mL DMEM/F12培养基的离心管中，置于冰上。于无菌超净工作台中取出肿瘤组织，置于含DMEM/F12培养基的的5ml离心管中，用无菌的外科剪刀10min内将肿瘤组织剪成1mm

第三步：将剪切至1mm

具体的，加入1～2ml DMEM/F12培养基将剪切至1mm

第四步：加入PCNSL培养基和matrigel进行充分混匀，PCNSL培养基和matrigel按1:4～1:9的比例添加，每个凹陷性小窝加入20ul混悬液；

具体的，将分装好的matrigel在4℃冰箱进行解冻，根据制备的凹陷性小窝的个数加入相对应的PCNSL培养基和matrigel。如制备12个凹陷性小窝，在糜状的PCNSL活检组织中加入48ul(4ul×12)PCNSL培养基和192ul(16ul×12)matrigel充分混匀，每个凹陷性小窝加入20ul混悬液。

Matrigel(Corning cat.no.356234)：未开封前保存于-20℃。使用前，在4℃冰箱缓慢融化，分装200uL/管，-20℃冻存。使用前，将分装好的matrigel在4℃冰箱缓慢融化后使用。推荐分装前在2～8℃过夜融化。其中，matrigel分装、加样均在冰上操作，动作需迅速，避免matrigel凝固。

其中，PCNSL培养基的成分包括：DMEM/F12，Neurobasal medium，N2 supplement，B27 supplement，2-mercaptoethanol，Human insulin，Glutamax，Sodium pyruvate，MEM，EGF，bFGF，Penicillin-Streptomycin。

具体的，每配制50ml各成分的体积或终浓度为：

DMEM/F12(HyClone,cat.no.SH30023.01),25ml；

Neurobasal medium(Invitrogen,cat.no.21103049),25ml；

N2 supplement(Invitrogen,cat.no.17502048),250ul；

B27 supplement(Invitrogen,cat.no.17504044),500ul；

2-Mercaptoethanol(Invitrogen,cat.no.21985023),其终浓度为3.5ul/L；

Insulin human recombinant(YESEN,cat.no.40112ES25),25ul 5mg/ml，终浓度2.5ug/ml；

Glutamax(Life Technologies,cat.no.35050-061),500ul；

Sodium pyruvate(Life Technologies,cat.no.11360-070),500ul；

MEM-Non-essential amino acids(Sigma,cat.no.M7145),250ul；

EGF(Peprotech,cat.no.AF-100-15),100ul 10ug/ml，其终浓度为20ng/ml；

bFGF(Peprotech,cat.no.100-18B),100ul 10ug/ml，其终浓度为20ng/ml；

Penicillin-Streptomycin(Biosharp,cat.no.BL505A),500ul。

其中，终浓度为3.5ul/L的2-Mercaptoethanol的配制：将2-Mercaptoethanol用DMEM/F12稀释100倍，即990ul DMEM/F12中加入10ul 2-Mercaptoethanol，充分混匀后，取出17.5ul加入。

人胰岛素的配制：将25mg胰岛素冻干粉用0.01M HCl 5ml溶解成母液浓度为5mg/ml的胰岛素，提供0.22uM滤膜过滤母液后100ul/管分装，-20℃储存。

EGF的配制：提供0.22uM滤膜过滤0.1％BSA，将100ug EGF加入5mM Tri溶液1ml充分溶解重悬，再用0.1％BSA稀释至浓度为10ug/ml(即0.1％BSA 900ul+100ug/ml EGF100ul)，分装保存100ul/管，-20℃储存。

bEGF的配制：提供0.22uM滤膜过滤0.1％BSA，将100ug bEGF加入5mM Tri溶液1ml充分溶解重悬，再用0.1％BSA稀释至浓度为10ug/ml(即0.1％BSA 900ul+100ug/ml bEGF100ul)，分装保存100ul/管，-20℃储存。

图2为matrigel包埋剪碎的PCNSL组织，每个凹陷性小窝中共20ul matrigel、PCNSL培养基和PCNSL组织的混悬液。

第五步：将封口膜置于6cm培养皿中并加入1-2ml PBS保湿，再放入37℃，5％CO

具体的，将matrigel包埋的PCNSL组织的封口膜置于6cm培养皿中，同时加入1～2ml PBS，不要超过封口膜表面。将6cm培养皿置于37℃，5％CO

第六步：将matrigel包埋的PCNSL组织取出置于12孔板中进行培养。

具体的，matrigel固化后从培养箱中取出，吸出PBS，用镊子将matrigel包埋的PCNSL组织从凹陷性小窝完整剥离置于12孔板中，3-4个/孔，每孔加入2ml PCNSL培养基。

第七步：每3～4天进行半换液，直至有原代PCNSL细胞从matrigel包埋的小球中溢出。

具体的，该例PCNSL患者的组织培养19天后发现细胞从matrigel包埋的小球中溢出，细胞圆形，聚团悬浮生长。

图3为两例PCNSL细胞从matrigel包埋的小球中溢出的4倍图(左)，10倍图(中间)和20倍图(右)，细胞呈圆形，聚团悬浮生长。

图4为两例PCNSL细胞标志物CD19，CD20的流式细胞展示图，流式细胞结果表明CD19 80.51％阳性，CD20 90.24％阳性，证实本实施例培养获得的原代细胞为PCNSL细胞。

实施例2原发性中枢神经系统淋巴瘤原代细胞的培养方法

从一名原发性中枢神经系统淋巴瘤(PCNSL)患者中获取活检组织标本(男，53岁)

原发性中枢神经系统淋巴瘤原代细胞的原代培养步骤包括：

第一步：使用封口膜在10ul枪头盒板上制作12～16个凹陷性小窝；

具体的，凹陷性小窝制作的步骤如下：(1)准备10ml圆头EP管，0.2ml PCR管，剪刀，镊子，10ul枪头盒板，6×6cm～8×8cm的封口膜；(2)制作组合小工具：用剪刀在10ml圆头EP管的合适部位(尾端)剪一个圆形缺口，大小稍大于PCR管开口，以能卡住0.2ml PCR管为宜；(3)用剪刀将6×6cm～8×8cm的封口膜裁剪成六边形；(4)将制作好的组合小工具、剪刀，镊子，10ul移液枪枪头盒板置于高压锅进行高压消毒；(5)提前将裁剪成八边形的封口膜浸泡于75％的酒精中24h以上；(6)将浸泡好的封口膜在超净工作台中取出待表面酒精挥发，置于10ul移液枪枪头盒板上，用镊子将封口膜的边角固定，手持组合小工具的一端，遵守无菌原则，用一定力度在封口膜上下压组合小工具，以出现能容纳20ul以上的圆形培养体的凹陷性小窝为宜；(7)根据PCNSL活检组织量制作12～16个小窝。

其中，可制作20ul以上的圆形培养体的工具组合均适用于本发明的后续步骤。

图1(a,b)，为制备凹陷性小窝的装置，封口膜需要提前置于75％酒精中浸泡消毒，用于制造凹陷性小窝的EP管、镊子、200ul枪头盒板需提前高压锅消毒。

第二步：将新鲜PCNSL组织置于DMEM/F12培养基中，无菌环境下剪切至1mm

具体的，立体定向活检的新鲜PCNSL组织，放入装有5mL DMEM/F12培养基的离心管中，置于冰上。于无菌超净工作台中取出肿瘤组织，置于含DMEM/F12培养基的的5ml离心管中，用无菌的外科剪刀10min内将肿瘤组织剪成1mm

第三步：将剪切至1mm

具体的，加入1～2ml DMEM/F12培养基将剪切至1mm

第四步：加入PCNSL培养基和matrigel进行充分混匀，PCNSL培养基和matrigel按1:4～1:9的比例添加，每个凹陷性小窝加入20ul液体量；

具体的，将分装好的matrigel在4℃冰箱进行解冻，根据制备的凹陷性小窝的个数加入相对应的PCNSL培养基和matrigel。如制备12个凹陷性小窝，在糜状的PCNSL活检组织中加入48ul(4ul×12)PCNSL培养基和192ul(16ul×12)matrigel充分混匀，每个凹陷性小窝加入20ul混悬液。

Matrigel：未开封前保存于-20℃。使用前，在4℃冰箱缓慢融化，分装200uL/管，-20℃冻存。使用前，将分装好的matrigel在4℃冰箱缓慢融化后使用。推荐分装前在2～8℃过夜融化。其中，matrigel分装、加样均在冰上操作，动作需迅速，避免matrigel凝固。

其中，PCNSL培养基的成分包括：DMEM/F12，Neurobasal medium，N2 supplement，B27 supplement，2-mercaptoethanol，Human insulin，Glutamax，Sodium pyruvate，MEM，EGF，bFGF，Penicillin-Streptomycin。

具体的，每配制50ml其成分为：

DMEM/F12(HyClone,cat.no.SH30023.01),25ml；

Neurobasal medium(Invitrogen,cat.no.21103049),25ml；

N2 supplement(Invitrogen,cat.no.17502048),250ul；

B27 supplement(Invitrogen,cat.no.17504044),500ul；

2-Mercaptoethanol(Invitrogen,cat.no.21985023),其终浓度3.5ul/L；

Insulin human recombinant(YESEN,cat.no.40112ES25),25ul 5mg/ml，其终浓度为2.5ug/ml；

Glutamax(Life Technologies,cat.no.35050-061),500ul；

Sodium pyruvate(Life Technologies,cat.no.11360-070),500ul；

MEM-Non-essential amino acids(Sigma,cat.no.M7145),250ul；

EGF(Peprotech,cat.no.AF-100-15),100ul 10ug/ml，其终浓度为20ng/ml；

bFGF(Peprotech,cat.no.100-18B),100ul 10ug/ml，其终浓度为20ng/ml；

Penicillin-Streptomycin(Biosharp,cat.no.BL505A),500ul。

其中，终浓度为3.5ul/L的2-Mercaptoethanol的配制：将2-Mercaptoethanol用DMEM/F12稀释100倍，即990ul DMEM/F12中加入10ul 2-Mercaptoethanol，充分混匀后，取出17.5ul加入。

人胰岛素的配制：将25mg胰岛素冻干粉用0.01M HCl 5ml溶解成母液浓度为5mg/ml的胰岛素，提供0.22uM滤膜过滤母液后100ul/管分装，-20℃储存。

EGF的配制：提供0.22uM滤膜过滤0.1％BSA，将100ug EGF加入5mM Tri溶液1ml充分溶解重悬，再用0.1％BSA稀释至浓度为10ug/ml(即0.1％BSA 900ul+100ug/ml EGF100ul)，分装保存100ul/管，-20℃储存。

bEGF的配制：提供0.22uM滤膜过滤0.1％BSA，将100ug bEGF加入5mM Tri溶液1ml充分溶解重悬，再用0.1％BSA稀释至浓度为10ug/ml(即0.1％BSA 900ul+100ug/ml bEGF100ul)，分装保存100ul/管，-20℃储存。

图2为matrigel包埋剪碎的PCNSL组织，每个凹陷性小窝中共20ul matrigel、PCNSL培养基和PCNSL组织的混悬液。

第五步：将封口膜置于6cm培养皿中并加入1-2ml PBS保湿，再放入37℃，5％CO

具体的，将matrigel包埋的PCNSL组织的封口膜置于6cm培养皿中，同时加入1～2ml PBS，不要超过封口膜表面。将6cm培养皿置于37℃，5％CO2的培养箱中1小时，待matrigel固化后取出。

第六步：将matrigel包埋的PCNSL组织取出置于12孔板中进行培养。

具体的，matrigel固化后从培养箱中取出，吸出PBS，用镊子将matrigel包埋的PCNSL组织从凹陷性小窝完整剥离置于12孔板中，3-4个/孔，每孔加入2ml PCNSL培养基。

第七步：每3～4天进行半换液，直至有原代PCNSL细胞从matrigel包埋的小球中溢出。

具体的，本实施例PCNSL患者的组织培养14天后发现细胞从matrigel包埋的小球中溢出，细胞圆形，聚团悬浮生长。

图4为PCNSL细胞标志物CD19和CD20的流式细胞展示图，流式细胞结果表明CD1989.20％阳性，CD20 92.39％阳性，证实本实施例培养获得的原代细胞为PCNSL细胞。