弥漫大B细胞淋巴瘤微小残留病变的实验与临床研究及原发性中枢神经系统淋巴瘤临床分析

摘要

第1章弥漫大B细胞淋巴瘤微小残留病变的实验与临床研究 背景和目的：近20多年来，由于人们对非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkinlymphoma，NHL)生物学行为的深入认识、有效药物的不断产生、新技术的应用以及综合治疗的实施，使B细胞NHL的治疗效果有了很大的提高，约80％的患者可以达到完全缓解(completeremission，CR)，但是一半以上的患者终究要复发。目前认为复发来源于体内残留的耐药淋巴瘤细胞，即微小残留病变(minimalresidualdisease，MRD)。如果这些导致复发的肿瘤细胞能被可靠地检测出来，对指导淋巴瘤患者缓解后的治疗、早期预测复发和预后、协助诊断分期将具有重要的意义，使我们的治疗有可能达到分子水平的CR。 目前，诊断淋巴瘤微小残留病灶，应用较多和较成功的是，定性PCR的方法检测骨髓、外周血干细胞和外周血单克隆IgH基因重排，协助分期、评价治疗效果或微小残留病变。该方法不能对起始模板数准确定量。但临床上发现阳性患者并非都出现复发或远处浸润。因此，推测IgH基因重排阳性患者是否复发，可能与IgH基因重排的表达量有关。实时荧光定量PCR(real-timefluorescencequantitativepolymerasechainreaction，RT-FQ-PCR)具有敏感性高，特异性强，快速、微量、定量分析的优点，非常适合用于检测微小残留病变。在B-NHL，染色体易位产生的融合基因和免疫球蛋白重链基因重排(immunoglobulinheavy-chaingenerearrangment，IgH-R)均可作为RT-FQ-PCR检测的靶分子。在弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuselargeBcelllymphoma，DLBCL)因BCL-2/IgH易位只占20％～30％，而BCL-6基因与IgH发生易位时的断裂点较分散，故使用IgH基因重排作为靶分子检测较为合适。但是由于VDJ重排的多样性使每一个B细胞克隆有它自己特异的DNA序列，即重排具有多样性，突变的存在，而且突变可发生在疾病发展的不同时期，使得通用的引物和探针的设计成为困难。荧光染料标记的定量PCR方法不需要合成探针，使应用RT-FQ-PCR检测DLBCL的微小残留病灶成为可能。 本研究采用简单、快速、敏感性和特异性较高的实时荧光定量PCR方法，采用荧光染料技术，结合半巢式PCR(semi-nestedPCR)方法，以IgH基因重排为标志，对DLBCL患者治疗前后骨髓微小残留病变进行定量分析，结合临床特征，探讨荧光染料标记的实时定量PCR方法检测DLBCL微小残留病变的可行性和临床意义。 方法：44例DLBCL患者的57份骨髓标本用于检测IgH基因重排，10例非B细胞淋巴瘤的骨髓做对照组，Namalwa细胞系作阳性对照，U-937细胞系作阴性对照。淋巴细胞分离液分离骨髓单个核细胞，酚—氯仿—异戊醇抽提DNA，半巢式PCR和SYBRGreen荧光染料标记的实时荧光定量PCR方法分别检测IgH基因重排CDRⅢ。2.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物片断大小，β-actin作内参照，对IgH基因重排相对定量。 结果：1.分析融解曲线可以确定IgH基因重排产物的特异性。荧光定量PCR和半巢式PCR检测IgH基因重排的阳性率分别为63.2％和71.9％。两种方法均能在骨髓形态学阳性的标本中检测到IgH基因重排，敏感性达到100％。在初治患者和复发难治患者之间，IgH基因重排的阳性率两种方法均无统计学差异。 2.荧光定量PCR检测IgH基因重排，以年龄、性别、分期、LDH值、IPI评分、肿块大小和B症状七个因素分组作比较，Ⅰ、Ⅱ期患者IgH基因重排表达量中位数为0，Ⅲ、Ⅳ期患者IgH基因重排表达量中位数为0.35，经统计学检验，两组患者之间有显著性差异(p=0.018)，其余各组之间IgH基因重排阳性率统计学无显著性差异。半巢式PCR的结果与之相似，Ⅰ、Ⅱ期患者IgH基因重排阳性率47.6％，Ⅲ、Ⅳ期患者IgH基因重排阳性率为82.6％，Ⅲ、Ⅳ期患者IgH基因重排阳性率高于Ⅰ、Ⅱ期患者(P=0.014)。 3.荧光定量PCR检测IgH基因重排，骨髓异型细胞数量与IgH基因重排表达量经相关性回归分析，统计学有显著性差异(P=0.002)，对治疗前后骨髓IgH基因重排的分析，4例骨髓形态学阳性者，随着治疗后细胞数量的减少和治疗的好转，IgH基因重排表达量也随之下降，动态观察表达量的变化可以评价疗效。 4.半巢式PCR检测IgH基因重排，7例患者治疗前IgH基因重排阳性，治疗后5例PR，2例SD，IgH基因重排仍然为阳性，提示病情未得到有效控制，可以帮助判断病情的发展趋势，但不能精确地反映疗效。 5.荧光定量PCR检测IgH基因重排，LDH值高于正常组，IgH基因重排表达量为0.39，LDH值低于正常组，IgH基因重排表达量为0.01，经非参数检验，两组患者之间有显著性差异(P=0.046)。 结论：1.荧光染料标记的定量PCR方法结合半巢式PCR可用于弥漫大B细胞淋巴瘤的骨髓微小残留病变的检测，荧光染料标记的定量PCR较半巢式PCR更好地反映骨髓微小残留病变情况。 2.检测骨髓IgH基因重排，可以协助分期，Ⅰ、Ⅱ期患者检测到IgH基因重排不能排除远处侵犯的可能。 3.动态观察IgH基因重排表达量，可以反映疾病变化过程，评价疗效。 4.未能确定检测微小残留病变在预测预后中的价值。 第2章原发性中枢神经系统淋巴瘤临床分析 背景与目的：原发性中枢神经系统恶性淋巴瘤(primarycentralnervoussystemlymphoma，PCNSL)发病率上升并且该病预后很差。本文目的是探讨免疫正常的中国人的PCNSL的临床特征，评价大剂量氨甲蝶呤(HD-MTX)治疗PCNSL的疗效。并探讨半巢式PCR检测免疫球蛋白重链基因重排在协助分型和分期诊断中的意义方法：回顾性分析经病理证实的32例(中位年龄50岁)PCNSL患者的临床资料和治疗效果。2001年11月以前采用CHOP方案为主单用或联合全脑放疗的治疗方法，2001年12月以后采用HD-MTX为主，单用或联合全脑放疗的治疗方法。半巢式PCR检测患者石蜡组织和骨髓涂片IgH基因重排。 结果：本组PCNSL患者45岁以上的占78.1％，颅内高压为主要表现占75％，单发病灶占78.1％，未检测到脑脊液细胞学阳性病例，B细胞淋巴瘤占87.5％，弥漫性大B细胞淋巴瘤59.4％。32例中位随访期17.5个月(1～84个月)，Kaplan-Meier分析总中位生存期26个月，2年生存率52％；HD-MTX联合放疗组患者完全缓解率64.7％，中位生存期在28个月以上，2年生存率66％，疗效明显优于非HD-MTX联合放疗组；Logrank检验显示乳酸脱氢酶正常、活动状态(PS)评分在0～1的患者生存期较长。Cox模型显示PS状况、LDH水平和治疗措施是PCNSL的预后因素，PS越大、LDH水平越高，生存期越短，使用HDMTX+WBRT治疗，患者生存期较长。 7例PCNSL中，5例检测到IgH基因重排(71.4％)。10例骨髓涂片标本，2例见IgH基因重排条带。 结论：PCNSL多发于中老年人，颅内高压为主要表现，B细胞亚型占绝对优势。大剂量MTX联合全脑放疗治疗PCNSL有效和可行。PS状况、LDH水平和是否接受HDMTX+WBRT是PCNSL的预后因子。PCNSL患者有可能伴有骨髓侵犯。

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第1章弥漫大B细胞淋巴瘤微小残留病变的实验与临床研究

第2章原发性中枢神经系统淋巴瘤临床分析

弥漫大B细胞淋巴瘤微小残留病变诊断的应用和意义（综述）

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