用于检测牛CRP蛋白的重组单链抗体及其应用

摘要

本发明涉及用于检测牛CRP蛋白的重组单链抗体及其应用。用于检测牛CRP蛋白的重组单链抗体包括C2抗体和/或C5抗体，C2抗体、C5抗体均分别包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，VH和VL通过柔性连接肽(G4S)3连接，C2抗体、C5抗体的VH和VL均分别包括框架区FR和互补决定区CDR。本发明的抗体可用于检测牛C－反应蛋白，具有稳定性好、特异性好、表达量高等优点。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及用于检测牛CRP蛋白的重组单链抗体及其应用。

背景技术

C－反应蛋白(C－reactive protein，CRP)，急性期蛋白之一，广泛分布于脊椎动物，人们通过高丙酮酸琼脂糖凝胶的钙依赖亲和层析，从牛血清中分离到两种不同的五肽蛋白。其中一种蛋白与某些兔抗人CRP抗血清发生交叉反应，因此被命名为牛CRP。其生物学功能包括：“抗炎”和“促炎”两种活动，具有多效性。CRP水平会随着损伤、感染和炎症而急剧增加并且随着病情的缓解而迅速下降。因此CRP被看作是检测牛炎症的一项灵敏的指标。

目前，对牛CRP的利用价值国内外研究较少，尤其没有用于检测牛CRP蛋白的重组单链抗体的报道。

发明内容

鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供用于检测牛CRP重组单链抗体、制备方法及应用，开发了一种稳定且特异性良好的抗体用于检测牛CRP，从而对牛的炎症进行诊断。本发明提出的重组单链抗体对于牛炎症的检测、诊断以及牛CRP的研究也提供了广阔的应用前景并具有重要的意义。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

用于检测牛CRP蛋白的重组单链抗体，包括C2抗体和/或C5抗体；

所述C2抗体包括重链可变区VH和轻链可变区VL；C2抗体VH和VL均分别包括框架区FR和互补决定区CDR；

C2抗体VH的FR包括SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列、SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列、SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列和SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列；C2抗体VH的CDR包括SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列、SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列和SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列；

C2抗体VL的FR包括SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列、SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列、SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列和SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列；C2抗体VL的CDR包括SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列、SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列和SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列；

所述C5抗体包括重链可变区VH和轻链可变区VL；C5抗体VH和VL均分别包括框架区FR和互补决定区CDR；

C5抗体VH的FR包括SEQ ID NO.17所示的氨基酸序列、SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列、SEQ ID NO.21所示的氨基酸序列和SEQ ID NO.23所示的氨基酸序列；C5抗体VH的CDR包括SEQ ID NO.18所示的氨基酸序列、SEQ ID NO.20所示的氨基酸序列和SEQ ID NO.22所示的氨基酸序列；

C5抗体VL的FR包括SEQ ID NO.24所示的氨基酸序列、SEQ ID NO.26所示的氨基酸序列、SEQ ID NO.28所示的氨基酸序列和SEQ ID NO.30所示的氨基酸序列；C5抗体VL的CDR包括SEQ ID NO.25所示的氨基酸序列、SEQ ID NO.27所示的氨基酸序列和SEQ ID NO.29所示的氨基酸序列。

进一步，用于检测牛CRP蛋白的重组单链抗体，包括C2抗体和/或C5抗体；

所述C2抗体包括重链可变区VH和轻链可变区VL；C2抗体VH和VL均分别包括框架区FR和互补决定区CDR；

C2抗体VH的FR包括FR1、FR2、FR3和FR4，C2抗体VH的FR1的氨基酸序列包括SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列，C2抗体VH的FR2的氨基酸序列包括SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，C2抗体VH的FR3的氨基酸序列包括SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列，C2抗体VH的FR4的氨基酸序列包括SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列；C2抗体VH的CDR包括CDR1、CDR2和CDR3，C2抗体VH的CDR1的氨基酸序列包括SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，C2抗体VH的CDR2的氨基酸序列包括SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，C2抗体VH的CDR3的氨基酸序列包括SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列；

C2抗体VL的FR包括FR1、FR2、FR3和FR4，C2抗体VL的FR1的氨基酸序列包括SEQ IDNO.8所示的氨基酸序列，C2抗体VL的FR2的氨基酸序列包括SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列，C2抗体VL的FR3的氨基酸序列包括SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列，C2抗体VL的FR4的氨基酸序列包括SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列；C2抗体VL的CDR包括CDR1、CDR2和CDR3，C2抗体VL的CDR1的氨基酸序列包括SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列，C2抗体VL的CDR2的氨基酸序列包括SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列，C2抗体VL的CDR3的氨基酸序列包括SEQ IDNO.13所示的氨基酸序列；

所述C5抗体包括重链可变区VH和轻链可变区VL；C5抗体VH和VL均分别包括框架区FR和互补决定区CDR；

C5抗体VH的FR包括FR1、FR2、FR3和FR4，C5抗体VH的FR1的氨基酸序列包括SEQ IDNO.17所示的氨基酸序列，C5抗体VH的FR2的氨基酸序列包括SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列，C5抗体VH的FR3的氨基酸序列包括SEQ ID NO.21所示的氨基酸序列，C5抗体VH的FR4的氨基酸序列包括SEQ ID NO.23所示的氨基酸序列；C5抗体VH的CDR包括CDR1、CDR2和CDR3，C5抗体VH的CDR1的氨基酸序列包括SEQ ID NO.18所示的氨基酸序列，C5抗体VH的CDR2的氨基酸序列包括SEQ ID NO.20所示的氨基酸序列，C5抗体VH的CDR3的氨基酸序列包括SEQ IDNO.22所示的氨基酸序列；

C5抗体VL的FR包括FR1、FR2、FR3和FR4，C5抗体VL的FR1的氨基酸序列包括SEQ IDNO.24所示的氨基酸序列，C5抗体VL的FR2的氨基酸序列包括SEQ ID NO.26所示的氨基酸序列，C5抗体VL的FR3的氨基酸序列包括SEQ ID NO.28所示的氨基酸序列，C5抗体VL的FR4的氨基酸序列包括SEQ ID NO.30所示的氨基酸序列；C5抗体VL的CDR包括CDR1、CDR2和CDR3，C5抗体VL的CDR1的氨基酸序列包括SEQ ID NO.25所示的氨基酸序列，C5抗体VL的CDR2的氨基酸序列包括SEQ ID NO.27所示的氨基酸序列，C5抗体VL的CDR3的氨基酸序列包括SEQ IDNO.29所示的氨基酸序列。

例如：C2抗体VH链的各部分可以按照以下顺序排列：C2抗体VH的FR1(SEQ IDNO.1)－C2抗体VH的CDR1(SEQ ID NO.2)－C2抗体VH的FR2(SEQ ID NO.3)－C2抗体VH的CDR2(SEQ ID NO.4)－C2抗体VH的FR3(SEQ ID NO.5)－C2抗体VH的CDR3(SEQ ID NO.6)－C2抗体VH的FR4(SEQ ID NO.7)；C2抗体VL链的各部分可以按照以下顺序排列：C2抗体VL的FR1(SEQ ID NO.8)－C2抗体VL的CDR1(SEQ ID NO.9)－C2抗体VL的FR2(SEQ ID NO.10)－C2抗体VL的CDR2(SEQ ID NO.11)－C2抗体VL的FR3(SEQ ID NO.12)－C2抗体VL的CDR3(SEQID NO.13)－C2抗体VL的FR4(SEQ ID NO.14)。

C5抗体VH链的各部分可以按照以下顺序排列：C5抗体VH的FR1(SEQ ID NO.17)－C5抗体VH的CDR1(SEQ ID NO.18)－C5抗体VH的FR2(SEQ ID NO.19)－C5抗体VH的CDR2(SEQID NO.20)－C5抗体VH的FR3(SEQ ID NO.21)－C5抗体VH的CDR3(SEQ ID NO.22)－C5抗体VH的FR4(SEQ ID NO.23)；C5抗体VL链的各部分可以按照以下顺序排列：C5抗体VL的FR1(SEQ ID NO.24)－C5抗体VL的CDR1(SEQ ID NO.25)－C5抗体VL的FR2(SEQ ID NO.26)－C5抗体VL的CDR2(SEQ ID NO.27)－C5抗体VL的FR3(SEQ ID NO.28)－C5抗体VL的CDR3(SEQID NO.29)－C5抗体VL的FR4(SEQ ID NO.30)。

采取上述技术方案的有益效果包括：

本发明提供的上述抗体，采用原核表达的牛CRP蛋白免疫Balb/c小鼠、从小鼠的脾脏细胞提取总RNA反转录得到的cDNA进行PCR扩增后建立重组单链抗体库、通过噬菌体展示技术对抗体库进行特异性筛选获得。C2抗体和C5抗体与抗原结合力高，具有稳定性好、特异性好、表达量高等优点，可以用于检测牛CRP，以开发用于牛炎症的检测、诊断、研究试剂及产品。

除了上述序列外，C2抗体和C5抗体也可以包括其他序列。

进一步，VH和VL通过柔性连接肽连接。

例如，柔性连接肽可以为柔性连接肽(G

进一步，C2抗体的核苷酸序列包括SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列；

和/或C2抗体的氨基酸序列包括SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列；

和/或C5抗体的核苷酸序列包括SEQ ID NO.31所示的核苷酸序列；

和/或C5抗体的氨基酸序列SEQ ID NO.32所示的氨基酸序列。

采取上述技术方案的有益效果包括：

本发明将所述重组单链抗体基因转入大肠杆菌中，建立在大肠杆菌中高效表达的重组单链抗体株，利用序列比对软件分析每个所述重组单链抗体株的基因序列，最后获得两个针对牛CRP蛋白的重组单链抗体的氨基酸序列。上述序列的抗体具有稳定性好、特异性好、表达量高等优点。

本发明提供一种核酸，编码上述抗体。

进一步，核酸的核苷酸序列包括SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列；

和/或在SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列添加、取代、缺失或插入一个或若干个核苷酸的序列；

和/或包括SEQ ID NO.31所示的核苷酸序列；

和/或在SEQ ID NO.31所示的核苷酸序列添加、取代、缺失或插入一个或若干个核苷酸的序列。

本发明提供一种载体，包括上述核酸。所述载体可以为克隆载体，也可以为表达载体。克隆载体上携带有编码上述抗体的核酸可以实现复制扩增的目的。表达载体上表达元件可以表达上述抗体。

本发明提供一种宿主细胞，包括上述载体。通过宿主细胞的繁殖可以实现载体上携带的抗体的核酸复制、扩增以及表达等目的。

本发明提供一种用于检测牛CRP蛋白的试剂，包括上述抗体。

本发明提供一种试剂盒，包括上述试剂。

所述试剂盒还可以包括：ELISA包被液、BSA、HRP标记Anti HA－tag抗体、TMB显色液、终止反应液中的一种或几种的组合。

本发明提供上述抗体、核酸、载体、宿主细胞、试剂、试剂盒中的一种或几种的组合在检测牛CRP蛋白中的应用。

本发明提供上述抗体、核酸、载体、宿主细胞、试剂、试剂盒中的一种或几种的组合在制备诊断牛的炎症的试剂或试剂盒中的应用。

例如：上述抗体、核酸、载体、宿主细胞、试剂、试剂盒中的一种或几种的组合可以在制备诊断与牛CRP蛋白相关的炎症的试剂或试剂盒中的应用。

例如，上述抗体、核酸、载体、宿主细胞、试剂、试剂盒中的一种或几种的组合可以在制备检测牛CRP蛋白的试剂或试剂盒中进行应用，也可以用于制备牛炎症的检测、诊断、研究试剂及其产品。具有稳定性好、特异性好等优点。

上述抗体、核酸、载体、宿主细胞、试剂、试剂盒中的一种或几种的组合可以基于C2抗体和C5抗体可分别与牛CRP蛋白特异性结合的原理在制备检测牛CRP蛋白的试剂或试剂盒中进行应用，以及在制备诊断牛的炎症的试剂或试剂盒中进行应用。

在进行应用时，可以采用ELISA等方法，检测本发明提供的单链抗体与牛CRP蛋白结合的情况，从而来检测牛CRP蛋白以及与牛CRP蛋白相关的炎症。

附图说明

图1为实施例1中，牛CRP蛋白基因经过原核表达系统表达，并经镍柱亲和层析纯化后的SDS－PAGE电泳图，M为蛋白分子量marker，Lane 1：原核表达的牛CRP蛋白；

图2为实施例4中，PCR方法添加了HA－tag的重组单链抗体基因片段电泳图，M为DNA分子量marker，Lane 1：C2单链抗体，Lane 2：C5单链抗体；

图3为实施例4中，牛CRP特异性重组单链抗体经纯化经镍柱亲和层析后的SDS－PAGE电泳图，M为蛋白分子量marker，Lane 1：C2单链抗体，Lane 2：C5单链抗体；

图4为实施例5中，ELISA方法鉴定重组单链抗体对牛CRP蛋白的特异性结合。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

pMECS质粒由比利时布鲁塞尔自由大学Serge Muyldermans教授惠赠。pET－22b载体和pET－25b载体质粒由本发明人所在实验室保存。

上述材料仅可由公众获得仅用于非商业目的重复本发明实施例所记载的实验以证明本实施例记载的效果。

E.coli Transetta(DE3)感受态购自北京全式金生物技术有限公司。Ni－NTA填料购自Sangon Biotech。TMB显色液购自Promega Biotechnology。HRP标记Anti HA－tag抗体购自南京金斯瑞生物科技有限公司。NotⅠ和Nco Ⅰ限制性内切酶购自New EnglandBiolabs。E.coli TG1感受态细胞、TG1菌、辅助性噬菌体M13K07购自GE公司。ELISA包被液、ELISA终止液，氨苄西林、卡那霉素、BSA、PEG－8000、PBS缓冲液、三乙胺均购自索莱宝公司。

根据牛CRP基因序列，通过化学合成的方法，对编码牛CRP成熟肽蛋白的基因进行合成，并在基因片段的上下游设计添加限制性内切酶NcoI和NotI位点，由Sangon Biotech公司合成。

实施例中所涉及的仪器、试剂材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

本发明公开了两株用于检测牛CRP蛋白的重组单链抗体及其制备方法。本发明采用原核表达的牛CRP蛋白免疫Balb/c小鼠，利用所述Balb/c小鼠的脾脏细胞作为抗体基因来源，从小鼠的脾脏细胞提取总RNA反转录得到的cDNA进行PCR扩增后建立重组单链抗体库。建立针对CRP单链抗体库，将表达并纯化的牛CRP蛋白包被在酶标板上作为抗原，通过噬菌体展示技术对抗体库进行特异性筛选。噬菌体展示技术中将外源DNA序列整合到噬菌体基因中，这种做法既保留了噬菌体的侵染特性，同时目的蛋白在噬菌体表面得到表达。将所需的DNA片段整合到M13噬菌体外壳蛋白Ⅲ或外壳蛋白Ⅷ的基因中，通过噬菌体自身的加工以及包装，使用主要外壳蛋白Ⅲ的方法提供了多价展示。获得了C2和C5两株单链抗体基因序列与抗原结合力高的重组单链抗体，分析单链抗体株的基因序列，获得针对牛CRP的重组scFv链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.32所示。本发明的抗体稳定性和特异性良好，可用于检测牛CRP。

实施例1构建特异性的单域重链噬菌体抗体库

(1)将牛CRP基因(GeneBank Sequence ID：AB255049.1)连接原核表达载体(pET－25b质粒)，并转化大肠杆菌(Transetta(DE3)感受态细胞)进行诱导表达，诱导表达的条件包括：按照1％的接种量，取菌液接种于诱导培养基中，37℃，300rpm，培养至菌液OD

(2)初次免疫，将前期原核表达的50μg牛CRP蛋白与同等体积的弗式完全佐剂(即体积比1：1)置于漩涡震荡仪使其充分振荡乳化，小鼠(Balb/c小鼠，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司)腹腔注射。

初次免疫后使用前期原核表达的50μg牛CRP蛋白与弗氏不完全佐剂混合进行后续免疫，免疫间隔周期为14天，共计免疫5次。每次免疫的方法都是采用小鼠腹腔注射，免疫方法相同。

(3)小鼠安乐死后取其脾脏研磨，溶于PBS缓冲液中，利用Trizol法提取其总RNA，将其反转录成cDNA，以cDNA为模板，PCR扩增小鼠抗体VH和VL基因，利用SOE－PCR扩增得到单链抗体基因scFv片段。

(4)将单链抗体基因片段经NotⅠ和NcoⅠ限制性内切酶双酶切后，与经过相同酶切的pMECS质粒载体进行连接，连接产物(片段大小750bp左右)转化至E.coli TG1感受态细胞中构建CRP特异性噬菌体抗体库，测定抗体库库容为1.3×10

实施例2富集与筛选CRP单链抗体

1)取构建好的CRP特异性噬菌体抗体库菌液按照1％的接种量接种至100mL 2×YT液体培养基中，37℃，250rpm，振荡培养2h后，加入辅助噬菌体M13K07(噬菌体侵染大肠杆菌的量为大肠杆菌的20倍)，37℃，250rpm，振荡培养1h。

2×YT液体培养基：称取7.5g酵母提取物，3.75g NaCl，12g胰蛋白胨，加入600ml蒸馏水，充分搅拌溶解后，定容至750ml，滴加NaOH，调节pH值至7.0，密封高压灭菌25min，4℃保存。

(2)将培养后的菌液置于4℃，2000rpm，10min；弃上清，重悬菌体沉淀至40mL 2×YT液体培养基(含氨苄西林100μg/mL和卡那霉素100μg/mL)，37℃，220rpm，过夜培养。

(3)菌液分装到离心管内，4℃，7197g离心25min，上清中加入20％PEG－8000/NaCl后，沉淀重组噬菌体，静置30min。

(4)噬菌体4℃，7197g，离心25min，弃上清，控干，用1mL PBS缓冲液(简称PBS)重悬沉淀，即为噬菌体抗体库。将噬菌体抗体库加入预先包被含有15μg/mL CRP蛋白的酶标板中，用封口膜封口，37℃结合1h。

(5)经PBST洗涤5遍后每孔加入100μL浓度为100mM三乙胺洗脱缓冲液，室温孵育10min。将洗脱的后重组噬菌体重新感染TG1菌，继续加入辅助噬菌体进行拯救(噬菌体与细菌的数量比为20：1)，同样的富集和筛选步骤反复进行五次，得到重组噬菌体侵染E.coliTG1。

实施例3phage－ELISA法筛选牛CRP蛋白特异性噬菌体

(1)重组噬菌体侵染E.coli TG1，并涂布在2×YT－AG固体培养基上(在2×YT固体培养基配方添加Amp和葡萄糖，Amp 100μg/mL，葡萄糖2％)，倒置于37℃恒温培养箱，过夜培养。

(2)随机挑取92个单克隆接种400μL的2×YT/AG液体培养基，再加入已稀释20倍的辅助性噬菌体M13K07，37℃，250rpm震荡培养2h后离心，弃上清并控干，沉淀用400μL的2×YT/AG液体培养基重悬，震荡培养16h后，离心，取上清300μl，加入120μl的20％PEG/NaCl充分混匀，4℃静置30min；

(3)30min后，4℃，10000rpm离心20min，弃上清，控干，100μL PBS重悬沉淀，用于Phage ELISA鉴定；

(4)每孔加入50μL PBS重悬液至预先包被5μg/mL CRP蛋白的酶标板中，室温结合2h，阴性对照孔为辅助噬菌体M13K07，空白对照为PBS；

(5)经PBST洗涤后每孔加入100μL TMB显色液避光显色10min，加入50μL ELISA终止液，测定OD405nm值，当试验组OD405nm值超过阴性对照值2.1倍以上即判定为阳性；

(6)将阳性克隆接种至5mL含100μg/mL氨苄西林的LB液体中以便提取质粒并进行测序；

根据序列比对软件DNAStar分析各个克隆株的基因序列，把基因序列相同的株视为同一克隆株，而其序列不同的株视为不同克隆株，最终筛选得到了2株单链抗体，分别命名为C2抗体和C5抗体；

经序列分析，C2抗体中，抗体重链(VH)和轻链(VL)通过柔性连接肽(G

经序列分析，C5抗体中，抗体重链(VH)和轻链(VL)通过柔性连接肽(G

实施例4牛CRP蛋白重组单链抗体的表达、纯化

(1)将实施例3Phage ELISA结果中的阳性克隆分别按照1％的接种量接种于5mL在2×YT－A液体培养基(在2×YT液体培养基中添加100μg/mL Amp)中培养过夜。

(2)次日，对培养后的菌液进行质粒提取并基因测序，经序列分析后，利用限制性内切酶NotⅠ和NcoⅠ将单链抗体基因片段从质粒上酶切下来，以单链抗体基因为模板，PCR方法在片段上加入HA－tag，图2为单链抗体基因片段加入HA－tag的结果图，再连接pET－22b载体，获得连接产物；

(3)将步骤(2)获得的连接产物转化E.coli Transetta(DE3)感受态，30℃低温诱导表达12h后，菌液经超声波破碎，收集上清和沉淀，SDS－PAGE分析表达情况，使用Ni－NTA镍柱填料对破碎上清进行纯化，收集纯化后的单链抗体，图3为纯化后的单链抗体，分别为C2单链抗体和C5单链抗体；

实施例5 ELISA鉴定重组单链抗体

(1)包被抗原：使用ELISA包被液将原核表达的CRP蛋白稀释至20μg/ml，每孔100μL，4℃过夜。室温放置30min；弃掉孔中液体，在纸上拍干，每孔加入300μL PBST，37℃，220rpm震荡洗涤3分钟，重复洗涤5次；

(2)每孔加入300μL 3％BSA，37℃，放置1.5h，洗涤；

(3)将单链抗体蛋白稀释至20μg/ml，每孔100μL，37℃孵育1.5h；以转化了pET－22b空载体大肠杆菌破碎液为阴性对照，PBS作为空白对照。

(4)每孔加入100μL 1：500稀释的HRP标记Anti HA－tag抗体。37℃孵育1h；

(5)每孔加入100μL TMB显色液，避光显色10min；

(6)每孔加入50μL ELISA终止液，测定OD450nm值。根据测定OD450nm值判断试验样品是否与CRP蛋白结合，如果试验组OD450nm值超过阴性对照OD450nm值2.1倍以上即判定为阳性(即能够与CRP蛋白结合)，如果试验组OD450nm值小于阴性对照OD450nm值2.1倍即判定为阴性(即不能够与CRP蛋白结合)。

图4为ELISA鉴定C2和C5抗体与牛CRP蛋白的结合活性的结果，从图4中可以看出C2抗体和C5抗体可以与牛CRP蛋白结合，并且C5抗体与牛CRP蛋白特异性结合活性比C2抗体高。

本发明采用原核表达的牛CRP蛋白免疫Balb/c小鼠，利用所述Balb/c小鼠的脾脏细胞作为抗体基因来源，建立针对CRP重组单链抗体库。一般的杂交瘤方法得到的抗体操作过程较为复杂且耗时，本发明则直接从小鼠的淋巴细胞通过三轮PCR的方法获得小鼠的单链抗体，操作简单且用时较少。将表达并纯化的牛CRP蛋白包被在酶标板上作为筛选抗原，利用噬菌体展示技术对所述重组单链抗体库进行免疫性筛选，获得针对牛CRP蛋白的重组单链抗体基因，通过测序获得其核苷酸和氨基酸序列。将所述重组单链抗体基因转入大肠杆菌中，建立在大肠杆菌中高效表达的重组单链抗体株，利用序列比对软件分析每个所述重组单链抗体株的基因序列。最后获得两个针对牛CRP蛋白的重组单链抗体的氨基酸序列。在大肠杆菌表达系统中能够大量制备纯度较高的单链抗体。使用ELISA方法对单链抗体进行鉴定后，发现其对牛CRP蛋白具有较好的结合活性。试验证明本发明制备的上述单链抗体稳定性和特异性均良好；并也证明了该重组单链抗体可以同牛CRP蛋白特异性结合，可应用于牛CRP蛋白的检测及牛炎症的诊断。

本发明实施例中未尽之处，本领域技术人员均可从现有技术中选用。

以上公开的仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以上述权利要求的保护范围为准。

序列表

<110> 内蒙古农业大学

<120> 用于检测牛CRP蛋白的重组单链抗体及其应用

<160> 32

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<230> C2抗体VH的FR1

<400> 1

Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Ala Ala Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<230> C2抗体VH的CDR1

<400> 2

Gly Tyr Thr Phe Pro Ser Tyr Trp

1 5

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<230> C2抗体VH的FR2

<400> 3

Met Gln Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val Gly

1 5 10 15

Glu

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<230> C2抗体VH的CDR2

<400> 4

Ile Asp Pro Ser Asp Asn Tyr Thr

1 5

<210> 5

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<230> C2抗体VH的FR3

<400> 5

Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr

1 5 10 15

Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<230> C2抗体VH的CDR3

<400> 6

Ala Arg Ser Ile Leu Arg Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<230> C2抗体VH的FR4

<400> 7

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 8

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<230> C2抗体VL的FR1

<400> 8

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser

20 25

<210> 9

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<230> C2抗体VL的CDR1

<400> 9

Ser Ser Val Ser Tyr

1 5

<210> 10

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<230> C2抗体VL的FR2

<400> 10

Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 11

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<230> C2抗体VL的CDR2

<400> 11

Asp Thr Ser

1

<210> 12

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<230> C2抗体VL的FR3

<400> 12

Asn Leu Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Gly Glu Asp Ala Ala

20 25 30

Thr Tyr Tyr Cys

35

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<230> C2抗体VL的CDR3

<400> 13

Gln Gln Trp Asn Ser Tyr Pro Phe Thr

1 5

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<230> C2抗体VL的FR4

<400> 14

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

1 5 10

<210> 15

<211> 726

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<230> C2抗体scFv

<400> 15

caggtcaaac tgcaggagtc tggggctgcg cttgtgaagc ctggggcttc agtgaagttg 60

tcctgcaagg cttctggcta caccttcccc agctactgga tgcagtgggt gaggcagagg 120

cctggacaag gccttgagtg ggtcggagag attgatcctt ctgataatta tactaactac 180

aatcaaaagt tcaagggcaa ggccacactg actgtagaca catcctccag cacagcctac 240

ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtgc aagatctata 300

ctacggccgt actactttga ctactggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctcatca 360

ggtggaggcg gttctggcgg aggtggctca ggcggtggag gctcggacat tgagctcacc 420

cagtctccag caatcatgtc tgcatctcca ggggagaagg tcaccatgac ctgcagtgcc 480

agctcaagtg taagttacat gcactggtac cagcagaagt caggcacctc ccccaaaaga 540

tggatttatg acacatccaa cctggctcct ggagtcccag ctcgcttcag tggcagtggg 600

tctgggaact cttattctct cacaatcagc agcatggagg gtgaagatgc tgccacttat 660

tactgccagc agtggaatag ttacccattc acgttcggtg ctggcaccaa gttggaactc 720

aaacgg 726

<210> 16

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<230> C2抗体scFv

<400> 16

Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Ala Ala Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Pro Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Asn Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Ile Leu Arg Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala

130 135 140

Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala

145 150 155 160

Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr

165 170 175

Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala Pro Gly Val

180 185 190

Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr

195 200 205

Ile Ser Ser Met Glu Gly Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

210 215 220

Trp Asn Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu

225 230 235 240

Lys Arg

<210> 17

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<230> C5抗体VH的FR1

<400> 17

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 18

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<230> C5抗体VH的CDR1

<400> 18

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp

1 5

<210> 19

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<230> C5抗体VH的FR2

<400> 19

Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

1 5 10 15

Tyr

<210> 20

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<230> C5抗体VH的CDR2

<400> 20

Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr

1 5

<210> 21

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<230> C5抗体VH的FR3

<400> 21

Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg

1 5 10 15

Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Phe Cys

35

<210> 22

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<230> C5抗体VH的CDR3

<400> 22

Ala Arg Arg Gly Tyr Tyr Ser Pro Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 23

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<230> C5抗体VH的FR4

<400> 23

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 24

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<230> C5抗体VL的FR1

<400> 24

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser

20 25

<210> 25

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<230> C5抗体VL的CDR1

<400> 25

Ser Ser Val Ser Tyr

1 5

<210> 26

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<230> C5抗体VL的FR2

<400> 26

Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 27

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<230> C5抗体VL的CDR2

<400> 27

Ser Thr Ser

1

<210> 28

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<230> C5抗体VL的FR3

<400> 28

Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala

20 25 30

Thr Tyr Tyr Cys

35

<210> 29

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<230> C5抗体VL的CDR3

<400> 29

Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Phe Thr

1 5

<210> 30

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<230> C5抗体VL的FR4

<400> 30

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Met Lys Arg

1 5 10

<210> 31

<211> 726

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<230> C5抗体scFv

<400> 31

caggtccagc tgcaggagtc aggggctgag ctggtgaggc ctgggtcctc agtgaagatg 60

tcctgcaagg cttctggcta cacctttact agctactgga tgcactgggt aaaacagagg 120

cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gcactggtta tactgagtac 180

aatcagaagt tcaaggacaa ggccacattg actgttgaca gatcttccaa cacagcctac 240

ctgcacctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct atttctgtgc aaggaggggg 300

tactatagtc cctggtttgc ttactggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctcatca 360

ggtggaggcg gttctggcgg aggtggctca ggcggtggag gctcggacat tgagctcacc 420

cagtctccag caatcatgtc tgcatctcca ggggagaagg tcaccataac ctgcagtgcc 480

agctcaagtg taagttacat gcactggttc cagcagaagc caggcacttc tcccaaactc 540

tggatttata gcacatccaa cctggcctct ggagtccctg ctcgcttcag tggcagtggg 600

tctgggaact cttattctct cacaatcagc cgaatggagg ctgaagatgc tgccacttat 660

tactgccagc aaaggagtag ttacccattc acgttcggct cggggaccaa gctggagatg 720

aaacgg 726

<210> 32

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<230> C5抗体scFv

<400> 32

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Gly Tyr Tyr Ser Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala

130 135 140

Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala

145 150 155 160

Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr

165 170 175

Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val

180 185 190

Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr

195 200 205

Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

210 215 220

Arg Ser Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Met

225 230 235 240

Lys Arg