抗-牛朊蛋白单链抗体检测系统的构建、表征与应用

摘要

朊病毒(prp<'sc>)是一种新型蛋白质感染因子，能够引起人和动物的可转移性神经退化疾病，如牛海绵状脑病(BSE)(或称疯牛病)和人的新型克雅氏病(nvCJD)。BSE已在世界范围内对养牛业和世界经济造成了巨大损失，由于受污染的牛制品可将疯牛病传染给人类，给人类健康构成了巨大威胁，因此建立特异、灵敏的牛朊病毒检测方法十分重要。 免疫学检测是牛朊病毒主要的检测方法，目前，用于检测的抗体为单克隆抗体。本研究尝试建立单链抗体介导的夹心蛋白芯片用于牛朊蛋白的检测。要获得抗牛朊蛋白单链抗体，首先构建噬菌体抗体库。由于牛和小鼠的PrP基因同源性约90％，为了避免出现免疫耐受，采用牛朊蛋白融合蛋白免疫小鼠。通过PCR和DNA重组构建了牛朊蛋白基因的原核表达载体，在基因水平上构建了硫氧还蛋白(TrxA)基因和牛朊蛋白基因的融合基因，并在大肠杆菌中进行了IPTG诱导表达硫氧还蛋白-牛朊蛋白融合蛋白(TrxA-bPrP<'c>)。Western blot分析表明该融合蛋白具有结合牛朊蛋白单克隆抗体的活性。采用TrxA-bPrP<'c>融合蛋白免疫小鼠成功突破了小鼠免疫耐受，诱导了抗牛朊蛋白抗体。通过PCR从牛朊蛋白融合蛋白免疫的小鼠脾脏B细胞中扩增抗体可变区基因片段(V<,H>，V<,L>)，然后通过OverlapPCR扩增抗体可变区基因，将体外组装的scFv基因片段克隆入噬菌体展示载体pCANTAB 5E，通过“吸附-洗脱-扩增”的富集过程，从噬菌体抗体库中筛选出针对牛朊蛋白特异的单链抗体Z163、Z186和Z1030。在此基础上构建了四个单链抗体融合蛋白：Z186-L-SBP、Z163-L-SBP、 Z163-Fc和Z1030-Fc，采用WesternBlot、SPR和Sandwich ELISA方法对其特性进行了研究。Western Blot结果表明Z186-L-SBP、Z163-L-SBP、Z1030-Fc和Z163-Fc可特异识别重组牛朊蛋白核心区片段的线性表位；用夹心ELISA对4个单链抗体融合蛋白及抗牛朊蛋白单克隆抗体KG9进行配对实验，Z186-L-SBP/Z163-Fc和Z163-L-SBP/KG9配对显示明显的阳性结果：用SPR方法测定了Zl63、Zl63-L-SBP、Zl63-Fc和Zl86-L-SBP的亲和力，其平衡解离常数(KD)分别为8.82×10<'-8>M、4.11×10<'-8>M、8.10×10<'-9>M和3.24x10<'-8>M。单链抗体融合蛋白Zl63-L-SBP亲和力是单链抗体Zl63的2.2倍，单链抗体融合蛋白Zl63-Fc亲和力是单链抗体Zl63的11倍，亲和力有明显的提高。Z186-L-SBP中SBP与streptavidin的平衡解离常数(KD)为5.97×10<'-9> M(5.97 nM)，Keefe等(2001)测得的未融合SBP的KD为2.5×10<'-9>M(2.5 mM)，亲和力略有下降，但基本上保持了原SBP的亲和力，可以用于作捕获抗体进行定向固定。 在上述配对实验的基础上发展了两种夹心抗体芯片：一种是基于单克隆抗体．单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片。将单克隆抗体KG9共价固定在多聚赖氨酸修饰的片基上作为捕获抗体；单链抗体融合蛋白Z163-L-SBP作为检测抗体，用偶联有streptavidin的量子点作为检测探针，与streptavidin亲和肽特异结合，该方法具有很高的特异性和灵敏度，检测限可达lpg／mL重组牛朊蛋白，并可以检测鼠脑中天然朊蛋白；另一种是基于两个单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片，将单链抗体融合蛋白Z186-L-SBP，通过SBP将Z186-L-SBP定向固定在streptavidin包被的片基上，作为捕获抗体，Cy3标记的Z163-Fc融合蛋白作为检测抗体，也具有很高的特异性和灵敏度，检测限也可达1pg／mL重组牛朊蛋白，并可以检测鼠脑中天然朊蛋白。两种夹心抗体芯片可以发展成为新的高灵敏度和高特异性的朊病毒检测系统。

目录

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书

摘要

英文缩写表

第一章前言

第二章重组牛朊蛋白的高效表达及活性鉴定

第三章噬菌体抗体库技术筛选抗牛朊蛋白单链抗体

第四章牛朊蛋白单链抗体及其融合蛋白的特性研究

第五章夹心抗体芯片检测朊蛋白的研究

参考文献

致谢

博士在读期间已发表和待发表论文题录