一种由大豆蛋白颗粒稳定的负载叶黄素酯的皮克林纳米乳液及其制备方法

摘要

本发明公开了一种由大豆蛋白颗粒稳定的负载叶黄素酯的皮克林纳米乳液及其制备方法。该方法为：将大豆分离蛋白分散于水中，加入蛋白酶进行限制性酶解，酶解结束后加热灭酶，离心取上清液进行干燥，获得大豆蛋白皮克林颗粒；将所获大豆蛋白皮克林颗粒溶解于水中，加入溶有叶黄素酯的油相与之混合搅拌，剪切预均质后采用高压均质处理，即得。本发明制备负载叶黄素酯的皮克林纳米乳液的方法，原料天然安全，过程中不涉及有机试剂，不引入合成乳化剂，工艺简单，条件温和；且生产的叶黄素酯皮克林纳米乳液具有良好的储藏稳定性与热稳定性，在功能性食品、功能饮料、化妆品、医药等行业具有广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于食品、医药及化妆品加工技术领域，具体涉及一种由大豆蛋白颗粒稳定的负载叶黄素酯的皮克林纳米乳液及其制备方法。

背景技术

叶黄素酯是一种重要的类胡萝卜素脂肪酸酯，在万寿菊中含量最为丰富。叶黄素酯经人体吸收后转化为叶黄素，主要存在于眼睛的黄斑区，帮助眼睛过滤蓝光；同时还具有抗氧化，预防机体衰老引发的心血管硬化、冠心病和肿瘤疾病等作用。2008年5月26日叶黄素酯被国家卫生部列为新资源食品，也可用于着色剂使用，然而叶黄素酯存在对光、热、氧气等敏感，稳定性差，溶解性和生物可给率低等问题，制约其在食品中的应用，所以研究高稳定性和高生物可给率的包埋封装体系具有重要意义。乳液运载体系因其具有疏水性内核，可有效荷载疏水物质，提升其在水中的分散性，在工业上已被广泛使用。

在乳液体系中，皮克林(Pickering)乳液因其具备极高的稳定性，同时具有抗聚结的优势，所以常用于活性因子缓释输送功能的应用。目前大部分皮克林乳液稳定剂都来源于无机材料，而利用天然生物大分子制备的皮克林乳液的粒径也大多为微米级，如何得到纳米级的食品级皮克林乳液，更好的实现功能因子的包埋与递送也是研究领域一直以来需要解决的难点。经研究发现，蛋白质、脂类、淀粉类均可以作为皮克林稳定剂，相比其它生物大分子，蛋白质具有更好的亲水亲油性，同时在生物相容性及生理活性方面更具优势。大豆蛋白作为现今食品工业生产和利用最广泛的植物蛋白，其来源丰富，价格低廉，营养价值高。但是由于大豆蛋白结构致密，水分散性较差，限制了其作为皮克林稳定剂的开发。

相关研究表明，酶解可以作为蛋白结构修饰与功能提升的有效手段之一，进一步拓宽大豆蛋白在工业上的应用范围。沈鹏辉等人的研究表明，经限制性酶解技术得到的大豆蛋白纳米颗粒具有高乳化活性，在制备高稳定性皮克林乳液方面具有应用潜力。(Shen,P.,Zhou,F.,Zhang,Y.,Yuan,D.,Zhao,Q.,&Zhao.M.(2020).Formation andcharacterization of soy protein nanoparticles by controlled partial enzymatichydrolysis.FOOD HYDROCOLLOIDS,105.)。

基于上述皮克林纳米乳液优良的物化稳定性和酶解法制备皮克林稳定剂的绿色高效，探讨利用大豆蛋白纳米颗粒制备负载叶黄素酯的皮克林纳米乳液具有强大的开发前景和应用价值。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种稳定性好、水分散性高以及安全性高的由大豆蛋白纳米颗粒稳定的负载叶黄素酯的皮克林纳米乳液。

本发明另一目的在于提供一种上述由大豆蛋白颗粒稳定的负载叶黄素酯的皮克林纳米乳液的制备方法。

本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。

本发明提供的一种由大豆蛋白颗粒稳定的负载叶黄素酯的皮克林纳米乳液的制备方法，包括以下步骤：

(1)将大豆分离蛋白分散于水中并搅拌均匀得到大豆蛋白分散液，常温下在搅拌状态下加入蛋白酶进行限制性酶解后，保温灭酶，待冷却后将离心获取的上清液进行干燥处理，得到大豆蛋白皮克林颗粒；

(2)将上述大豆蛋白皮克林颗粒溶于水中，室温下搅拌均匀作为后续制备皮克林乳液的水相；

(3)将叶黄素酯粉末与油混合，加热溶解并搅拌均匀作为后续制备皮克林乳液的油相；

(4)将步骤(2)中得到的水相与步骤(3)中得到的油相混合均匀，控制大豆蛋白纳米颗粒与油相的质量比为1:2-1:10，剪切机预乳化后，采用高压均质机处理，得到负载叶黄素酯的皮克林纳米乳液。

进一步地，步骤(1)中，所述大豆分离蛋白与水的质量体积比为1-15：100(w/v，g/mL)。

优选地，步骤(1)中，所述大豆分离蛋白与水的质量体积比为8-12:100(w/v，g/mL)。

进一步地，步骤(1)中，所述搅拌速率为300-600rpm，搅拌时间为1-3h。

优选地，步骤(1)所述搅拌速率为400-500rpm，搅拌时间为1-2h。

进一步地，步骤(1)中，所述在搅拌状态下的搅拌速率为200-400rpm；所述蛋白酶为胰酶、37071、中性蛋白酶、风味蛋白酶中的一种及以上；所述蛋白酶的质量为大豆分离蛋白质量的0.1wt％-1wt％；所述酶解时间为10-120min；所述灭酶温度为60-90℃，所述灭酶时间为5-60min。

优选地，步骤(1)所述搅拌速率为200-300rpm。

优选地，步骤(1)所述蛋白酶的质量为大豆分离蛋白质量的0.1wt％-0.8wt％。

优选地，步骤(1)所述酶解时间为15-60min。

优选地，步骤(1)所述灭酶温度为60-80℃，所述灭酶时间为5-30min。

进一步地，步骤(1)中，所述离心的速度为6000-10000rpm，所述离心次数为1-3次，所述离心时间为10-40min。

优选地，步骤(1)所述离心速度为6000-8000rpm，所述离心次数为1-2次，所述离心时间为10-15min。

进一步地，步骤(1)中，所述干燥的方式为冷冻干燥及喷雾干燥中的一种；所述冷冻干燥的温度为-40℃～-50℃，冷冻干燥的真空度小于1mbar，冷冻干燥的时间为20-30h；所述喷雾干燥的进风温度为160-180℃，喷雾干燥的排风温度为70-90℃。

优选地，步骤(2)干燥的方式选用冷冻干燥的方式时，所述冷冻干燥的时间为20-25h。

优选地，步骤(2)干燥的方式选用喷雾干燥的方式时，所述喷雾干燥的进风温度为170-180℃，所述喷雾干燥的排风温度为80-90℃。

进一步地，步骤(2)中，所述大豆蛋白皮克林颗粒为步骤(1)中经胰酶、37071、中性蛋白酶、风味蛋白酶酶解制备的大豆蛋白皮克林颗粒中的一种及以上；所述搅拌速率为200-600rpm，搅拌时间为1-3h。

优选地，步骤(2)所述搅拌速为率为200-400rpm，搅拌时间1-2h。

进一步地，步骤(3)中，所述叶黄素酯与油的质量比为1:4-1:50。

优选的，步骤(3)所述叶黄素酯与油的质量比为1:10-1:50。

进一步地，步骤(3)中，所述的油为中链甘油三酸酯、玉米油、大豆油中的一种及以上；所述搅拌速率为100-500rpm；加热温度为40-70℃，加热时间为10-60min。

优选地，步骤(3)所述的油为中链甘油三酸酯。

优选地，步骤(3)所述搅拌速率为200-500rpm。

优选地，步骤(3)所述加热温度50-65℃，加热时间为10-30min。

进一步地，步骤(4)中，所述剪切条件为：剪切速率为8000-15000rpm，剪切时间为1-5min。

优选地，步骤(4)所述剪切速率为10000-12000rpm，剪切时间为2-4min。

进一步地，步骤(4)中，所述高压均质条件为：均质压力30-100Mpa，均质次数1-6次。

优选地，步骤(4)所述高压均质压力为40-80Mpa，均质次数为2-4次。

本发明提供一种由上述大豆蛋白纳米颗粒稳定的负载叶黄素酯的皮克林纳米乳液，其特征在于，所述负载叶黄素酯的皮克林纳米乳液粒径为100-200nm，呈金黄色，未出现悬浮物，乳液细腻均一；乳液经长期放置，粒径仍为100-200nm，且在放置过程中也没有出现乳析现象。

相对于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果：

1、本发明提供的由大豆蛋白纳米颗粒稳定的负载叶黄素酯的皮克林纳米乳液制备方法，首次利用大豆蛋白颗粒作为皮克林稳定剂，可以很好的提高叶黄素酯的水溶性与稳定性。

2、本发明提供的由大豆蛋白纳米颗粒稳定的负载叶黄素酯的皮克林纳米乳液制备方法，涉及的制备步骤简单，易工业化生产，且制备过程未涉及醇类等有机试剂，绿色安全无毒副作用。

附图说明

图1为实施例1-实施例4及对比例1制得的乳液外观图。

图2为实施例1-实施例4及对比例1制得的乳液稀释100倍后的透光图。

图3a-图3e为实施例1-实施例4及对比例1制得的乳液放大400倍的光学显微镜图。

图4为实施例1-实施例2制得的皮克林纳米乳液室温贮藏一个月前后外观图。

图5为实施例4及对比例1制得的乳液室温贮藏一个月叶黄素酯含量变化图。

图6为实施例4及对比例1制得的乳液在95℃加热4h条件下叶黄素酯含量变化图。

具体实施方式

以下结合附图和实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。

以下各实施例中，粒径的测定方法如下：

采用纳米粒度仪(Nano-ZS&MPT-2型纳米粒度仪，英国Malvern公司)测定制备的大豆蛋白颗粒及其稳定的皮克林纳米乳液粒度，得到平均粒度值(nm)及分散性指数(PDI)的数据。

叶黄素酯保留率可通过下面的公式计算得到：

实施例1

大豆蛋白纳米颗粒的制备：将60g市售大豆分离蛋白加入6000mL去离子水中并通过搅拌桨在300rpm速率下搅拌1h得到蛋白液，并且于搅拌状态下加入0.6g胰蛋白酶于常温下酶解20min，酶解结束后，于70℃加热20min进行灭酶处理，待冷却后，离心取上清液(离心的速率为6000rpm，离心的时间为40min，离心的次数为1次)，进行冷冻干燥，冷冻干燥的温度为-40℃，冷冻干燥的真空度小于1mbar，冷冻干燥的时间为20h，得到大豆蛋白纳米颗粒粉末样品。

皮克林纳米乳液的制备：将2g大豆蛋白纳米颗粒粉末加入180mL去离子水中，室温下通过磁力搅拌器在200rpm速率下搅拌2h，于4℃过夜充分水合，得到皮克林乳液的水相体系；将0.4g市售叶黄素酯粉末加入20g中链甘油三酸酯中，40℃下加热，并通过磁力搅拌器在速率100rpm下搅拌30min，待叶黄素酯充分溶解后，冷却至室温得到皮克林乳液的油相体系；将上述水相和油相混合均匀，先用剪切机8000rpm处理5min后，采用高压均质机处理，均质压力为30Mpa，均质6次得到由大豆蛋白颗粒稳定的负载叶黄素酯的皮克林纳米乳液。

实施例2

大豆蛋白纳米颗粒的制备：将500g市售大豆分离蛋白粉加入5000mL去离子水中并通过搅拌桨在600rpm速率下搅拌1h得到蛋白液，并且于搅拌状态下加入2.5g风味蛋白酶于常温下酶解10min，酶解结束后，于60℃加热60min进行灭酶处理，待冷却后，离心取上清液(离心的速率为6000rpm，离心的时间为20min，离心的次数为2次)，进行冷冻干燥，冷冻干燥的温度为-50℃，冷冻干燥的真空度小于1mbar，冷冻干燥的时间为30h，得到大豆蛋白纳米颗粒粉末样品。

皮克林纳米乳液的制备：将4g大豆蛋白纳米颗粒粉末加入180mL去离子水中，室温下通过磁力搅拌器在200rpm速率下搅拌3h，于4℃过夜充分水合，得到皮克林乳液的水相体系；将0.4g市售叶黄素酯粉末加入20g大豆油中，50℃下加热，并通过磁力搅拌器在速率100rpm下搅拌30min，待叶黄素酯充分溶解后，冷却至室温得到皮克林乳液的油相体系；将上述水相和油相混合均匀，先用剪切机10000rpm处理3min后，采用高压均质机处理，均质压力为50Mpa，均质4次得到由大豆蛋白颗粒稳定的负载叶黄素酯的皮克林纳米乳液。

实施例3

大豆蛋白纳米颗粒的制备：将300g市售大豆分离蛋白加入2000mL去离子水中并通过搅拌桨在400rpm速率下搅拌2h得到蛋白液，并且于搅拌状态下加入1.5g中性蛋白酶于常温下酶解120min，酶解结束后，于75℃加热5min进行灭酶处理，待冷却后，离心取上清液(离心的速率为10000rpm，离心的时间为10min，离心的次数为3次)，进行喷雾干燥，控制进风温度为180℃、排风温度为90℃，最后得到大豆蛋白纳米颗粒粉末样品。

皮克林纳米乳液的制备：将6g大豆蛋白纳米颗粒粉末加入180mL去离子水中，室温下通过磁力搅拌器在400rpm速率下搅拌1h，于4℃过夜充分水合，得到皮克林乳液的水相体系；将4g叶黄素酯粉末加入20g玉米油中，60℃下加热，并通过磁力搅拌器在速率500rpm下搅拌20min，待叶黄素酯充分溶解后，冷却至室温得到皮克林乳液的油相体系；将上述水相和油相混合均匀，先用剪切机12000rpm处理1min后，采用高压均质机处理，均质压力为100Mpa，均质1次得到由大豆蛋白颗粒稳定的负载叶黄素酯的皮克林纳米乳液。

实施例4

大豆蛋白纳米颗粒的制备：将150g市售大豆分离蛋白加入1000mL去离子水中并通过搅拌桨在600rpm速率下搅拌1h得到蛋白液，并且于搅拌状态下加入0.15g 37071蛋白酶于常温下酶解60min，酶解结束后，于90℃加热10min进行灭酶处理，待冷却后，离心取上清液(离心的速率为6000rpm，离心的时间为30min，离心的次数为1次)，进行喷雾干燥，控制进风温度为160℃、排风温度为70℃，最后得到大豆蛋白纳米颗粒粉末样品。

皮克林纳米乳液的制备：将10g大豆蛋白纳米颗粒粉末加入180mL去离子水中，室温下通过磁力搅拌器在500rpm速率下搅拌1h，于4℃过夜充分水合，得到皮克林乳液的水相体系；将2g叶黄素酯粉末加入20g中链甘油三酸酯中，70℃下加热，并通过磁力搅拌器在速率400rpm下搅拌10min，待叶黄素酯充分溶解后，冷却至室温得到皮克林乳液的油相体系；将上述水相和油相混合均匀，先用剪切机15000rpm处理2min后，采用高压均质机处理，均质压力为50Mpa，均质3次得到由大豆蛋白颗粒稳定的负载叶黄素酯的皮克林纳米乳液。

对比例1

将10g原始大豆分离蛋白加入180mL去离子水中，室温下通过磁力搅拌器在500rpm搅拌1h，于4℃过夜充分水合，得到乳液的水相体系；将2g叶黄素酯粉末加入20g中链甘油三酸酯中，70℃下加热，并通过磁力搅拌器在速率400rpm下搅拌10min，待叶黄素酯充分溶解后，冷却至室温得到乳液的油相体系；将上述水相和油相混合均匀，先用剪切机15000rpm处理2min后，采用高压均质机处理，均质压力为50Mpa，均质3次得到由大豆分离蛋白稳定的负载叶黄素酯的乳液。

对实施例1-4制备的大豆蛋白颗粒、对比例中大豆分离蛋白以及由大豆蛋白颗粒/大豆分离蛋白稳定的负载叶黄素酯的乳液进行动态光散射分析得到其粒径和多分散指数，结果如表1所示。本发明所得的大豆蛋白颗粒粒径小，分布均一，而未经酶解的大豆分离蛋白粒径与分散系数较大；由大豆蛋白颗粒可制得稳定的皮克林纳米乳液，乳液粒径均小于200nm，具有良好的分散性(分散系数均小于0.3)。而对比例1中，未经蛋白酶酶解的大豆分离蛋白所制得的乳液粒径和分散系数显著大于酶解后的蛋白纳米颗粒所制得的乳液；

表1

图1是实施例1-4及对比例制备得到的乳液表观图，由图1可知，由大豆蛋白颗粒稳定的负载叶黄素酯的乳液外观均一，呈现亮黄色，表面无油析出。

图2是实施例1-4及对比例制备得到的乳液在稀释100倍后的的透光图。由图2可知，由大豆蛋白颗粒稳定的乳液的透光性明显好于对比例1。

图3a-图3e是实施例1-4及对比例制备得到的乳液光学显微镜图，由图3a-图3d可以看出由大豆蛋白颗粒稳定的皮克林乳液粒径小，分布均一，而由原始大豆蛋白稳定的乳液(图3e)粒径较大，分布不均。

图4是实施例1-4与对比例1制得的乳液贮存一个月前后外观图，由图4可知，本发明制得的由大豆蛋白颗粒稳定的负载叶黄素酯的皮克林乳液稳定性优异，放置1个月后未出现分层和析油现象。

对实施例4与对比例1制备得到的乳液进行贮藏稳定性(20℃，30天)表征，对不同贮藏天数实施例4与对比例1乳液中叶黄素酯保留率进行测定，对比结果如图5所示，结果表明对比例1中叶黄素酯的保留率显著低于实施例4。因此，由大豆蛋白颗粒稳定的负载叶黄素酯的皮克林乳液具有更好的贮藏稳定性，对于活性物质叶黄素酯的保护作用更大。

对实施例4与对比例1制备得到的乳液进行加热稳定性(95℃，4h)表征，对不同加热时间点实施例4与对比例1乳液中叶黄素酯保留率进行测定，对比结果如图6所示，结果表明对比例1中叶黄素酯的保留率显著低于实施例4。由大豆蛋白颗粒稳定的皮克林纳米乳液可以有效提升叶黄素酯的热稳定性。

以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。