一种PEG修饰鸢尾素类似物及制备方法

摘要

本发明公开了一种PEG修饰鸢尾素类似物及制备方法，属于生物技术领域。一种PEG修饰鸢尾素类似物的结构式为：所述鸢尾素类似物是将鸢尾素59位的半胱氨酸突变成丝氨酸，其氨基酸序列见SEQ ID NO1。该类似物具有长效性。本发明的制备方法包括如下步骤：1)鸢尾素类似物质粒的构建，2)重组质粒的转化，3)工程菌种的发酵，4)包涵体溶解，5)阴离子柱纯化，6)透析复性及酶切，7)Ni柱纯化，8)PEG修饰，9)修饰样品反相纯化。本发明解决了鸢尾素在复性过程中出现错误二聚体以及在体内稳定性差的问题。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种PEG修饰蛋白类似物及制备方法，特别的是一种PEG修饰鸢尾素类似物及制备方法。

背景技术

鸢尾素(Irisin)是Bostrom等于2012年发现的一个新型调节因子。有研究表明运动可以增加骨骼肌合成鸢尾素。由于其存在的多种代谢调控功效，渐渐地发展成为近年来研究的一个热点，然而由于其起始密码子为ATA(不同于常用的起始密码子ATG)，且由于相关技术的限制，其存在一直受到质疑，直到最近有科学家通过MS技术将鸢尾素的分子量鉴定出来，才使得其存在被普遍认可。其主要功能是使BAT(白色脂肪细胞)褐化，使其变成棕色脂肪细胞，而棕色脂肪细胞的功能则主要是产热。且对于二型糖尿病患者所产生的胰岛素拮抗和血糖的稳定有一定的治疗作用。近年研究发现，鸢尾素对帕金森病上也有潜在的治疗作用。随着鸢尾素的细胞受体αv整合蛋白的发现，将加快鸢尾素作用机理的揭示，并有望成为一种新的治疗药物得到开发。

鸢尾素的前体III型纤连蛋白结构域蛋白5(FNDC5)，FNDC5是一个跨膜蛋白，其中含有209个氨基酸，从N端开始1-29位的氨基酸为一个信号肽，30-123位氨基酸组成了一个FNIII结构域，其后又包含了一个无序序列(其中包含形成鸢尾素的酶切位点，但此酶尚未被揭示)和一个跨膜的疏水序列，以及一个与细胞质结合的序列。当FNDC5在酶的作用下被切断后就释放鸢尾素，进入人体循环中。在人体血液中的浓度为3-4ng/ml，在运动、寒冷等刺激下可以增加其分泌量，且有研究表明其含量与人体内的白色脂肪细胞含量呈反相关。鸢尾素分布广泛，其前体FNDC5在骨骼肌和富含肌肉的心包和直肠中表达最多，在心脏有一定的表达，在脑、肾脏、肝脏以及脂肪组织中有较少的表达。

研究发现，鸢尾素对肥胖、骨重建、糖尿病等均有一定的调控作用。但其在人体血液中的半衰期只有1小时，过短的半衰期限制了它作为药物得到开发。

发明内容

为解决鸢尾素在复性过程中出现错误二聚体以及在体内稳定性差的问题，本发明提供了一种PEG修饰鸢尾素类似物及制备方法，该类似物具有长效性。

本发明目的是由以下技术方案实现的：

一种PEG修饰鸢尾素类似物(PEG-Irisin类似物)，该类似物具有长效性，该类似物的结构式为：

所述鸢尾素类似物(Irisin类似物)是将鸢尾素59位的半胱氨酸突变成丝氨酸，其氨基酸序列见SEQ ID NO1。

进一步的，本发明目的还可以由以下技术方案实现：

一种PEG修饰鸢尾素类似物的制备方法，包括如下步骤：

1)合成鸢尾素类似物重组蛋白基因片段，将重组蛋白基因N端前段加入DDDDK和6个His序列，得到目的基因；

2)运用重组基因技术将目的基因与质粒结合，导入宿主细菌中，筛选得到正确表达宿主细菌；

3)发酵步骤2)所得宿主细菌，正确表达目的融合蛋白后，破碎细菌，得目的蛋白粗产物；

4)纯化步骤3)所得蛋白粗产物得到纯度较高的鸢尾素类似物；

5)使用PEG类似物定点修饰步骤4)所得鸢尾素类似物的N端得PEG修饰鸢尾素类似物；

6)对步骤5)所得PEG修饰鸢尾素类似物进行纯化。

所述步骤2)的质粒包括pMAL-c5X质粒，所述宿主细菌包括大肠杆菌、毕赤酵母中的任意一种。

所述宿主细菌为大肠杆菌B21菌种。

所述步骤4)包括：a阴离子色谱柱纯化，b透析酶切，c亲和Ni柱纯化；其中，阴离子色谱柱为Q柱，阴离子Q柱纯化的pH值为7.0-8.0，纯化所使用的洗脱缓冲液的盐包括Tris-Hcl、Na

所述阴离子Q柱纯化的pH值为7.4，所使用的洗脱缓冲液的盐为Tris-Hcl，所述Ni柱纯化pH值为7.5，所使用的洗脱缓冲液的盐为Tris-Hcl及咪唑。

所述步骤5)中使用的PEG类似物为聚乙二醇丙酸脂琥珀酰亚胺，分子量为2000-20000，所述PEG类似物定点修饰的位点为鸢尾素类似物的游离-NH

所述游离-NH

所述步骤6)所用纯化方法为反相色谱柱纯化，洗脱缓冲液的盐为Tris-Hcl、Na

所述反相色谱柱为C18色谱柱，洗脱缓冲液的盐为Na

有益效果：

鸢尾素序列中第59位是半胱氨酸残基，容易同另一条链上的半胱氨酸形成二硫键，严重影响了鸢尾素在后续过程中的纯化和复性，结构分析表明该半胱氨酸并不在于肽链的活性位点上，对其进行突变，突变为类似结构的丝氨酸，降低了其对复性的影响。

聚乙二醇可用来修饰蛋白质药物的高分子聚合物。通过PEG修饰可降低生物原性，提高半衰期。通过聚乙二醇的定点修饰，对某些修饰位点进行保护，或者优化修饰条件使得修饰的位点单一。

本发明解决了鸢尾素在复性过程中出现错误二聚体以及在体内稳定性差的问题。更进一步地说：本发明的第一目的是解决鸢尾素在复性过程中出现错误二聚体的问题，其办法是将其59位的Cys进行突变Ser。第二目的是使用PEG类似物修饰鸢尾素类似物，提高其稳定性，其修饰位点为N末端的α-NH

附图说明

图1为鸢尾素类似物重组蛋白结构；

图2为PEG修饰Irisin类似物结构式；

图3为单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸脂结构式；

图4为目的蛋白表达电泳图；

图5为Q柱纯化电泳图；

图6为修饰后反相纯化图谱；

图7为HPLC检测结果图；

图8为油红O染色阴性对照组结果

图9为油红O染色阳性对照组结果；

图10为为油红O染色实验组结果

图11为吸收值测定结果；

图12为鸢尾素类似物电泳结果；

图13为鸢尾素热处理5天稳定性实验结果；

图14为鸢尾素类似物-PEG热处理5天稳定性实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步详细的阐述，给出的实例仅为阐述本发明，而非限制本发明的范围。

实施例1

一种PEG修饰鸢尾素类似物，该类似物的结构为：

所述鸢尾素类似物是将鸢尾素59位的半胱氨酸突变成丝氨酸，其氨基酸序为：

DSPSAPVNVTVRHLKANSAVVSWDVLEDEVVIGFAISQQKKDVRMLRFIQEVNTTTRSSALWDLEEDTEYIVHVQAISIQGQSPASEPVLFKTPREAEKMASKNKDEVTMKE。

实施例2

一种PEG修饰鸢尾素类似物的制备方法，包括如下步骤：

1)鸢尾素类似物质粒的构建

合成鸢尾素类似物重组蛋白基因片段，在鸢尾素类似物基因的前端加入一个DDDDK氨基酸的基因，便于之后使用EK酶进行酶切，在其前端加入一个HHHHHH氨基酸序列，将其连接在PMAL-c5X质粒上；完成质粒的构建。

2)重组质粒的转化

取制备好的4管感受态细胞，分别加入重组质粒缓慢搅拌均匀后冰浴30min，42℃热休克90s，立即放入冰水混合物2min，每管中各加入300μL LB培养基，于37℃放置1h。取100μL菌液涂于LA平板，正置30min后，然后于37℃培养箱中倒置培养10h。

3)工程菌种的发酵

取正确构建的菌种，按照1:100接种于LB培养基中(300μl菌种接种于30ml培养基中)，37℃，220rpm，活化培养6小时。之后再将活化菌按1:100移入新的培养基(5ml活化菌种接种于500ml培养，4瓶)，37℃，220rpm，培养4小时，加入IPTG继续培养4小时后收集菌体，得约10g。

4)包涵体溶解

称取菌体10g按1：10用100ml PBS 1％Tritonx-100 100ml氯化钠低温混悬30min，使用细胞超声破碎机破碎细胞，时间30min，功率18％，冰浴控制低温。破碎完成后，离心取沉淀，再使用100ml PBS 100mM氯化钠5mM EDTA洗涤细胞30min，离心取沉淀。取沉淀2.5g按质量体积比1：50用20mM Tris 8M尿素0.1％β-巯基乙醇pH 8.3溶解沉淀，至沉淀无明显大颗粒蛋白后离心，取上清。

5)阴离子柱纯化

使用平衡液(20mM Tris 8M尿素pH 7.5)平衡色谱柱5个柱体积左右，缓慢上样，收集穿透。上样完成之后，再使用平衡液复平衡色谱柱5个柱体积左右，最后使用洗脱液(20mMTris 200mM氯化钠8M尿素pH 7.5)缓慢洗脱目的蛋白。再使用纯水冲洗色谱柱5个柱体积，再使用0.5M氢氧化钠洗脱杂蛋白，使用纯水冲洗色谱柱冲洗5个柱体积，再使用2M氯化钠冲洗色谱柱，然后用纯水冲洗色谱柱，最后用20％乙醇保存色谱柱。纯化电泳图如6。

6)透析复性及酶切

按体积比1：20使用截留量为7000的透析袋透析目的蛋白，每3小时更换一次透析液(50mM tris 0.1％Tween-20pH 8.0)，更换2次，最后一次透析过夜，控制低温。然后，估计目的蛋白的含量，按照0.5mg对应1U，加入EK酶对样品进行酶切。

7)Ni柱纯化

使用Ni柱亲和色谱柱，用平衡液(20mM Tris 10mM咪唑100nM NaCl pH7.5)平衡色谱柱5个柱体积左右，缓慢上样，收集穿透。上样完成之后，再使用平衡液复平衡色谱柱，收集与穿透合并。最后使用洗脱液(20mM Tris 500mM咪唑500nM NaCl pH 7.5)缓慢洗脱杂蛋白。再使用纯水冲洗色谱柱5个柱体积，最后用20％乙醇保存色谱柱。

8)PEG修饰

按体积比1：20使用截留量为7000的透析袋透析目的蛋白，每3小时更换一次透析液(50mM乙酸-乙酸钠pH 7.5)，更换2次，最后一次透析过夜，控制低温，得透析液。用DMSO将修饰剂(单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸脂)溶解成1-10mg/ml后，按修饰比例1：1.5将修饰剂缓慢加入到修饰缓冲液中(透析样品)，于4℃修饰过夜。

9)修饰样品反相纯化

使用C18色谱柱对修饰后样品进行反相纯化，使用平衡液(20mM乙酸钠10％乙腈pH7.5)平衡色谱柱5个柱体积，将修饰样品加载入色谱柱，再使用平衡液平衡色谱柱至基线平稳，使用洗脱液(20mM乙酸钠50％乙腈pH 7.5)洗脱目的蛋白，最后使用80％甲醇冲洗色谱柱,并保存。纯化图谱如图7。收集主峰用HPLC检测纯度，结果如图8。

实施例3

Irisin类似物-PEG活性实验

将分化前的3T3-L1细胞按20W个每瓶接种于25ml细胞培养瓶中，共接种3瓶。再加入3ml 10％FBS DMEM培养基，放置于37℃，5％CO

吸光度值测定：弃去油红O染色的细胞中的蒸馏水，加入1mL异丙醇浸泡10min。收集浸泡液，每个样取三次，每次取200ul加入到96孔板中，用酶标仪在492nm处检测其吸收值。结果如图10。

吸光度值测定结果

结论：实验组活性约为阳性对照组的81.3％。

实例4

验证Irisin类似物二聚体是否未生成

分别用8M尿素溶解Irisin包涵体与Irisin类似物包涵体，离心取上清，再分别取Irisin溶解液和Irisin类似物溶解液各60μl加入20μl 4x非还原性的电泳上样Buffer，再取60μl Irisin溶解液加入20μl 4x还原性的电泳上样Buffer，水浴煮沸5-10min；备用。配制10％的SDS-PAGE胶。进行电泳，电泳条件为：50V电压持续30min，120V持续90min。电泳结束后,使用革兰氏染色液染色3小时，再用脱色液脱3次，每次30分钟。结果如图11。结果分析，比较Irisin(非还原性)和Irisin(还原性)的电泳条带，其最大的区别是在100k-150k处Irisin(非还原性)有一条带，而Irisin(还原性)的电泳条带没有。经过还原性Buffer处理之后可以打开蛋白质中的二硫键，所以可以判断Irisin包涵体中有错误折叠的二硫键。而Irisin类似物中并未有此条带，说明Irisin包涵体未有形成错误的二硫键。达到本专利目的。

实例5

Irisin类似物稳定性实验

取同一批次制备的Irisin、Irisin-PEG冻干粉各5瓶，留1瓶对照，将其中4瓶放入60℃烘箱中，分别于1天、2天、5天、10天之后取出。用200μl PBS充分溶解后，进行HPLC检测。HPLC图谱如图12、13检测结果如下表：

Irisin对照品含量随时间变化情况

Irisin类似物-PEG含量随时间变化情况

结果分析：在最初的1day内Irisin对照品与Irisin类似物-PEG的降解速率相当，但在2day之后，Irisin对照品的降解速率明显大于Irisin类似物-PEG的降解速率，且在5-10day左右降解完全，而Irisin类似物-PEG类似物在10day依然有55％左右的含量，验证了PEG修饰Irisin类似物可以增加其稳定性的结论。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；作为本领域技术人员对本发明的多个技术方案进行组合是显而易见的。而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 重庆大学

<120> 一种PEG修饰鸢尾素类似物及制备方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1

<400> 1

Asp Ser Pro Ser Ala Pro Val Asn Val Thr Val Arg His Leu Lys Ala

1 5 10 15

Asn Ser Ala Val Val Ser Trp Asp Val Leu Glu Asp Glu Val Val Ile

20 25 30

Gly Phe Ala Ile Ser Gln Gln Lys Lys Asp Val Arg Met Leu Arg Phe

35 40 45

Ile Gln Glu Val Asn Thr Thr Thr Arg Ser Ser Ala Leu Trp Asp Leu

50 55 60

Glu Glu Asp Thr Glu Tyr Ile Val His Val Gln Ala Ile Ser Ile Gln

65 70 75 80

Gly Gln Ser Pro Ala Ser Glu Pro Val Leu Phe Lys Thr Pro Arg Glu

85 90 95

Ala Glu Lys Met Ala Ser Lys Asn Lys Asp Glu Val Thr Met Lys Glu

100 105 110