一种水产品诺如病毒GI型和GII型联合定量检测试剂盒

摘要

本发明属于生物检测技术领域，提供一种水产品诺如病毒GI型和GII型联合定量检测试剂盒，包括微滴式数字PCR法定量检测诺如病毒GI型和GII型用的两组引物探针，由序列表SEQ ID No.1至序列表SEQ ID No.6所示的核苷酸序列组成。本发明所述试剂盒通过在检测体系中对两个检测目标使用不同的荧光标记，实现一次加样，检测多个目靶标。本发明所述试剂盒具有高灵敏性和特异性，检测定量限低至20copy/反应，定性限低至6.6Copy/反应。本发明所述方法不依赖阳性标准品，检测过程无需标准曲线，不依赖于Ct值即可对病毒载量进行绝对的定量分析，可实现GI型和GII型诺如病毒的联合同步定量检测，有效提高了检测效率。

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体地，涉及一种水产品诺如病毒GI型和GII型联合定量检测试剂盒。

背景技术

诺如病毒(Norovirus，NoV)是引起急性非细菌性胃肠炎的主要病原之一，诺如病毒具有致病率高、感染剂量低、对外界抵抗力强等特点，使得诺如病毒感染性腹泻在全世界范围内均有流行，全年均可发生感染，感染对象主要是成人和学龄儿童。常见果蔬(草莓、生菜等)和贝类(牡蛎、青口等)已被列为诺如病毒污染的高风险食品。

诺如病毒归属于嵌杯病毒科(Caliciviridae)诺瓦克样病毒属(Norwalk-likevirus)，该科病毒包括5个属，分别为诺洛病毒、诺瓦克病毒、兔出血病病毒、札如病毒和鼠疫病毒。该病毒为单股正链RNA病毒，无包膜，基因组长度约为7.6kb，在电镜下观察，其结构为小圆形的病毒粒子。是一种单链RNA病毒，无囊膜，直径大约27～32nm。诺如病毒含有40多种不同的病毒株，根据其基因特征，主要分为6个基因型，GⅠ到GⅥ，其中GⅠ、GⅡ和GⅣ基因型主要感染人类，而GⅢ和GⅤ可感染猪、牛和鼠。依据病毒衣壳蛋白(VP1)序列和RNA依赖的RNA聚合酶多态性的配对分布，每个基因型可进一步分为不同的基因亚型，GⅠ有8个基因亚型，GⅡ有至少17个，其中基因型GⅡ，亚型4的诺如病毒(GⅡ.4)，占目前全世界流行的诺如病毒的70％-80％，主要引发人感染病毒性肠胃炎，GⅡ.4可通过定期的点突变或基因重组积累而产生新毒株，表现出基因/抗原的多样化，几乎是每隔两三年便会出现新的变异株，从而引发大的流行。

诺如病毒引起人类感染的主要是GI和GII群，感染者发病突然，主要症状为恶心、呕吐、发热、腹痛和腹泻，也可见头痛、寒颤和肌肉痛等症状，严重者可出现脱水症状。贝类(牡蛎、青口螺等)已被列为诺如病毒污染的高风险食品。贝类是生长在港湾的双壳软体动物，易受到流入海水的淡水的污染，当人们生食或食用加热不彻底的贝类时，就有可能受到感染。根据国外流行病学调查和实验室验证，许多胃肠炎暴发疫情都与生吃生蚝等贝类食品有关，因此，贝类产品中诺如病毒的检测，对于保障食品安全致关重要。

目前，诺如病毒的检测方法中实时荧光PCR是公认的最好的广泛应用的检测方法。但是，实时荧光PCR检测有时在样品中仅存在痕量诺如病毒的情况下，往往检测结果不稳定。由于食品中的病毒量往往很低，检测灵敏度的提高至关重要，ddPCR能弥补实时荧光PCR的这些缺陷，进一步提高检测的敏感性和结果稳定性。

中国专利“201610632652.6、一种精确定量检测诺如病毒Ⅰ型的试剂盒及检测方法的专利”中，公开了一种精确定量检测诺如病毒Ⅰ型的试剂盒及检测方法。该技术方案利用微滴式数字PCR技术精确定量检测诺如病毒Ⅰ型的检测方法，该方法无需依赖有证标准物质或其他标准品，具有更高的精确度、灵敏度和重复性，易于标准化。其引物和探针的设计方法为：选取诺如病毒分型基因片段RdRp-VP1，通过NCBI在线工具进行序列分析和比对，利用Prime Express软件V4.0(ABI,Foster City,CA,USA)设计出10余对引物和探针组合，经过筛选最终获得特异性强、适用于RT-ddPCR引物/探针组合各1套，其中探针5’端标记FAM，3’端标记BHQ1。同时，中国专利“201610632899.8、一种精确定量检测诺如病毒Ⅱ型的试剂盒及检测方法”也公开了类似的检测诺如病毒Ⅱ型的技术。

中国专利“201710630764.2、一步法微滴数字PCR定量检测果蔬中GII型诺如病毒的方法”公开一种一步法微滴数字PCR定量检测果蔬中GII型诺如病毒的方法。该方法利用RT-ddPCR，结合用于RT-qPCR检测GII型诺如病毒的引物和探针，进行反应，实现GII型诺如病毒的高灵敏快速检测。本方法灵敏度高，可达约2copies/μL，而常规的RT-qPCR的灵敏度通常为10copies/μL左右；扩增效率高，扩增效率为95.4％，R2＝0.9973。在低拷贝数下比RT-qPCR更能有效规避果蔬中抑制物的影响，减少了假阴性的产生。但是，由于针对的物种不同，因此导致检测引物和探针的选择具有明显差异。

期刊《农产品质量与安全》、ISSN号：1674-8255，2019年第4期，公开了“贝类中GII型诺如病毒的微滴式数字PCR定量检测方法”的学术论文，其中记载了采用微滴数字PCR(ddPCR)技术，建立RT-ddPCR快速定量检测GⅡ型诺如病毒的方法，该方法中只能够对GⅡ型诺如病毒进行检测，具有一定的局限性。

期刊《食品安全质量检测学报》、ISSN：2095-0381，2019年第24期，公开了“双重荧光数字PCR方法定量检测贝类中诺如病毒”的学术论文，其中记载了采用数字RT-PCR的方法，其引物和探针选自期刊《J Virol Methods》2015,223中的文献“Multi plexreal-timeRT-PCR for the simultaneous detection and quantification of GI,GII and GIVnoroviruses”；由于诺如病毒基因型复杂，而检测引物和探针的选择是参照real-timeRT-PCR的方式，存在简并碱基,因此数字PCR中阳性微滴和阴性微滴之间会有拖尾现象。

因此，需要提供一种应用ddPCR技术对贝类诺如病毒GI型和GII型联合定量检测方法，提高检测效率，同时实现对贝类中诺如病毒的定量检测、提高检测结果的稳定性，并实现贝类中诺如病毒的绝对定量，以实现对口岸进行进出口食品风险鉴管和预警。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种新型的水产品诺如病毒GI型和GII型联合定量检测试剂盒。

本发明的技术方案为；

一种水产品诺如病毒GI型和GII型联合定量检测试剂盒，其特征在于，包括检测诺如病毒GI型和GII型用引物探针组，由序列表SEQ ID No.1至序列表SEQ ID No.6所示的核苷酸序列组成；其中SEQ ID No.1至SEQ ID No.2所示的核苷酸序列为用于扩增GI型诺如病毒RNA的引物，SEQ ID No.3所示的核苷酸序列为用于扩增GI型诺如病毒RNA的探针；其中SEQ ID No.4至SEQ ID No.5所示的核苷酸序列为用于扩增GII型诺如病毒RNA的引物，SEQID No.6所示的核苷酸序列为用于扩增GII型诺如病毒RNA的探针。

进一步的，用于扩增GI型诺如病毒RNA的探针中，5’端标记荧光报告基团HEX，3’端标记荧光淬灭基团BHQ1。

进一步的，用于扩增GII型诺如病毒RNA的探针中，5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记荧光淬灭基团BHQ1。

本发明中，所述探针为TaqMan探针。

本发明通过从NCBI查找GI、GII型诺如病毒所有同源序列，根据GI型诺如病毒标准株(NC_001959.2)，GII型诺如病毒标准株(MT238671.1)的所有同源基因序列，用DNAMAN软件分别进行同源性比对，各筛选出一段高度保守序列，并以之为模板，用Oligo7软件，设计引物及TaqMan探针，并利用NCBI的BLAST工具筛查其特异性和包容性。

本发明检测GI、GII型诺如病毒的引物及探针设计遵循以下原则：引物与模板要紧密互补，两套引物相互之间避免形成二聚体或发夹结构，上下游引物的长度一般为18-25bp之间，且Tm值在58-60℃之间。确保引物中GC含量在40-60％。应避免引物中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。引物的3’端最好不为G或/和C。Taqman探针的长度应在20-32bp之间，且Tm值在68-72℃之间，确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出10℃，探针的5’端不能为G，因G可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号，从而导致假阴性的出现。Taqman探针的位置应靠近与其在同一条链上的引物，这样，可保证在将来扩增时，即便没有完全扩增，也有荧光信号报告出来。

在现有技术中，对于诺如病毒研究最多的为GII型，且已获得较多的基因组序列，虽对于GI型的基因组序列也有研究，但是被公开报道的基因组序列不多，由于双重检测的影响因子增多，且不同的目标片段其性质并不一致，尤其是对引物的敏感度不同，设计适合ddPCR反应的能同步特异性检测GI和GII型诺如病毒的双重特异性引物组存在较大的难度。本发明通过对GeneBank中的GI、GII型病毒标准株基因组的筛选比对，找到其中一段高度保守的基因保守片段，进而设计出一组能特异性联合定量检测GI、GII的特异性引物。为确保引物探针的特异性，将设计好的序列在BLAST中核实，如果发现有非特异性互补区，将重新设计探针。本研究共设计四组引物探针以供实验验证，筛选出最合适的两组用于后续实验。

由于应用于ddPCR的引物探针设计对引物探针扩增效率要求较高，且为双重检测，所以本发明的引物设计比普通引物设计难度更大，一方面要使用各种生物信息软件和专业网站进行大量的筛查和验证。同时还要考虑设计出的引物在ddPCR反应中的适用性。发明人在研究中发现，本发明中的扩增片段长度要控制在70-150bp，才有利于ddPCR扩增反应的进行，过长会增加微滴内反应的后期循环阻力，检测分析时形成密集的“下雨”现象，导致阴阳性微滴难以区分。

反应体系和反应条件会对扩增产生决定性影响，通过不断的试验优化，分别在反应体系和反应条件两方面进行摸索，以期得到最佳的试剂浓度和反应温度。本研究针对熔解温度、引物使用浓度和探针的使用浓度进行反复试验，得到其最佳反应浓度和温度。

熔解温度(Tm)即50％的引物碱基与模板结合为双链DNA的温度，是引物的一个重要参数。反应退火温度一般设定比引物的Tm低5℃，合理的退火温度从55℃到65℃。本发明通过oligo软件自动计算引物的Tm值。两套引物的Tm值相差1℃以内时，效果最佳。引物Tm差异如果超过5℃，会由于使用较低的退火温度而出现引物与模板结合时的错配。Taqman探针的Tm值应比引物的Tm值高10℃。在设置退火温度时可以如下进行：以低于估算的引物Tm值5℃作为起始的退火温度，以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。本发明的ddPCR反应体系中Tm值优选55-65℃，最佳为55℃。

引物的浓度会影响扩增特异性和扩增效率。最佳的引物浓度一般在0.1到1.0μM。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。为了确定引物浓度，研究用不同的引物浓度组合，进行多次实验，确定最佳浓度配比。

进一步的，所述试剂盒的反应体系为：

进一步的，所述试剂盒的反应体系为：

进一步的，所述试剂盒的反应条件为：

升温速度为2℃/s。

进一步的，所述试剂盒的反应条件为：

升温速度为2℃/s。

进一步的，所述水产品为贝类。

本发明提供两组引物和探针用于检测GI和GII型诺如病毒，引物对I的序列如SEQID NO:1和SEQ ID NO:2所示，探针I的核苷酸序列如SEQ ID NO:,3所示；引物对II的序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示，探针II的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；利用上述引物和探针能够同时检测GI和GII型诺如病毒特异性保守基因片段，可以用于GI和GII型诺如病毒的精确定量联合检测。所述探针I和引物对I的检测通道为VIC，所述探针II和引物对II的检测通道为FAM。本发明还提供一种包含上述引物和探针的用于检测GI和GII型诺如病毒的试剂盒，所述试剂盒还包括反应预混液、质控核酸和无核酸酶水。

本发明所述试剂盒通过在检测体系中使用不同荧光标记探针，进行多重荧光标记，多重数字PCR体系同时检测多个诺如病毒基因型，提高检测效率。方法不依赖标准品和标准曲线，灵敏度高、特异性强，能对样品进行绝对定量检测，进一步提高了GI型和GII型诺如病毒的联合定量检测水平。

本发明所述试剂盒具有高灵敏性和特异性，能够检测到低至6.6copies/反应的阳性，避免了荧光定量可能出现的假阴性；同时设置两个检测通道，避免了加样过程中可能造成的污染。本发明所述检测试剂盒检测速度快，整个检测过程仅需要4小时即可完成，可以满足市场需求。

附图说明

图1为本发明诺如病毒数字PCR特异性结果一维散点图；

图2为本发明诺如病毒数字PCR一维散点图；

图3为本发明诺如病毒数字PCR标准线性范围拟合标准曲线；

图4为本发明不同稀释度诺如病毒数字PCR微滴生成数目柱状图；

图5为本发明诺如病毒数字PCR标准线性范围验证一维散点图；

图6为本发明诺如病毒数字PCR的LOQ验证一维散点图；

图7为本发明诺如病毒数字PCR的LOD验证一维散点图；

图8为本发明诺如病毒数字PCR检测的精密度验证浓度图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明，并不限定本发明的保护范围。

实施例1

本实施例提供一种用于检测水产品GI型和GII型诺如病毒的引物、探针，具体包括：

引物设计：研究获得GI型和GII型诺如病毒的保守序列，选取ORF1和ORF2的连接点设计引物，此区域在病毒序列中高度保守。再通过在NCBI网站中查找GI型和GII型诺如病毒基因序列，找到其中的保守区域；最后使用Oligo 7软件设计特异引物，并通过BLAST验证引物探针的适用性。诺如病毒引物探针序列见下表1：

表1诺如病毒GⅠ型引物探针序列表

实施例2

本实施例提供一种水产品GI型和GII型诺如病毒的检测试剂盒及检测方法，具体包括：

A.RNA提取及浓度测定：采用TRIzol经典提取法提取病毒核酸样本，使用核酸蛋白分析超威量分光亮度计(Nano Drop 2000)，测定RNA浓度。

分别取RNA样本2μL，使用核酸蛋白分析超威量分光亮度计(Nano Drop2000)，测定RNA浓度，RNA的浓度按照以下公式计算获得：C＝A×40

式中：

C——RNA浓度(ng/μL)

A——260nm处的吸光值

1OD260nm＝40ng/μL RNA

OD260/OD280比值在1.8-2.2时提取的核酸模板适宜于PCR扩增检测。

B.检测试剂盒的反应体系与反应条件

(1)数字PCR反应体系，如下表2所示。

表2数字PCR反应体系

(2)数字PCR反应条件，如下表3所示。

表3数字PCR反应条件

实验效果验证

1、特异性验证实验

取诺如病毒(Norovirus，NV)核酸，以及甲肝病毒(Hepatitis A virus，HAV)、轮状病毒(Rotavirus，RV)、腺病毒(Adenovirus，AdV)、星状病毒(Astrovirus，AsV)、札如病毒(Sapovirus，SaV)核酸作为阴性进行本方法特异性的验证。采用建立的数字PCR方法进行检测，判定实验结果。

本试验采用数字PCR方法对已设计合成的引物探针进行筛选，结果表明该组引物探针能有效扩增出靶基因，并对其特异性进行了验证。GI引物探针组仅能扩增出GI诺如病毒，对其他病毒核酸均无扩增。GII引物探针组仅能扩增出GII型诺如病毒，对其他病毒核酸均无扩增。

表4引物探针特异性验证试验结果

热点图如图1所示，图中通道1为GI型，通道2为GII型。A02、B02、C02为诺如病毒核酸，D02-H02依次为甲肝病毒、轮状病毒、腺病毒、星状病毒、札如病毒核酸，试验结果表明这两组引物探针特异性较好。

2、诺如病毒数字PCR阳性样品以及扩增稳定性验证

为测试建立的微滴数字PCR诺如病毒的阳性样品以及扩增稳定性，取原始提取基因组稀释至1500拷贝/μL的工作浓度待用。按照上述反应体系进行数字PCR体系的配置，做3个重复。

为测试建立的微滴数字PCR诺如病毒的阳性样品以及扩增稳定性，取原始提取基因组稀释至1500拷贝/μL的工作浓度待用。按照推荐的反应体系进行数字PCR体系的配置。在此反应体系中，模板的添加量为2μL，预期体系中的拷贝数为3000个。实验设置3个平行。数字PCR获得的热点图如图2所示，实验结果的数据分析如表6所示。根据反应所得热点图所示，数字PCR所获得的阴性点与阳性点之间有明显的荧光信号差距，可以通过设置统一的阈值限进行阴性反应点和阳性反应点的区分。

从表6可以看出，该步反应最终结果，GI型三次扩增重复的实际检测拷贝数分别为3160、3120和3200，平均检测拷贝数为3160，相对标准偏差(Relative StandardDeviation,RSD)为1.27％，处于可接受的范围内(小于等于10％)；GII型三次扩增重复的实际检测拷贝数分别为3080、3060和3120，平均检测拷贝数为3087，RSD为0.99％，处于可接受的范围内(小于等于10％)。因此，本研究中所用的引物探针扩增稳定性良好，并且该标准品稳定可用。

表6诺如病毒阳性样品和扩增稳定性验证

3、诺如病毒数字PCR的线性范围验证

将阳性样品的基因组用超纯水进行7个梯度的梯度稀释，在诺如病毒核酸上样量为2μL的情况下，分别对应60000，30000，3000，300，60，20，6.6拷贝/反应。将以上梯度稀释组的模板进行数字PCR检测，每个浓度梯度组包含3个平行。

线性范围是指数字PCR检测体系可以进行诺如病毒绝对定量检测的范围。由于本方法是基于数字PCR的定量检测，所以确定本方法的线性范围对界定本方法的适用范围具有重要意义。

将阳性样品的基因组用超纯水进行7个梯度的梯度稀释，在诺如病毒核酸上样量为2μL的情况下，分别对应60000，30000，3000，300，60，20，6.6拷贝/反应。将以上梯度稀释组的模板进行数字PCR检测，每个浓度梯度组包含3个平行。该组实验检测结果如表7所示。

表7诺如病毒数字PCR标准的线性范围验证

由实际拷贝数拟合标准曲线可以看出(图3)，拟合标准曲线的r

单个样品内总微滴数是检验实验好坏的指标，可接受的平均微滴数目为12000，由图4可知，所有反应生成的可接受的滴数目均在14000以上，均大于12000，表明所有反应微滴生成正常，保证了后续实验结果分析的准确性。

由图5可知，所有稀释度均有阳性和阴性微滴，满足泊松分布，不存在所有微滴均被阳性核酸饱和，无阴性微滴存在的情况，所以数据有效；且可看出，随着稀释度的增高，阳性微滴逐步减少。

4、诺如病毒数字PCR定量灵敏度检测(检测限(LOQ)和定量限(LOD))

取上一步线性范围下限的样品和在线性范围验证中可以稳定扩增的最低浓度组分别进行LOQ和LOD的验证。将该样品分别进行十个平行的数字PCR验证，计算每个平行的单位体积的拷贝数，计算平均值和RSD值。

在本方法中，定量检测限(Limit Of Quantitation,LOQ)和检测限(Limit OfDetection,LOD)分别被定义为可以进行稳定定量检测或者检测的最低拷贝数。

取上一步线性范围下限的样品进行LOQ的验证。将样品进行十个平行的数字PCR验证，计算每个平行的单位体积的拷贝数，计算平均值和RSD值。该步骤实验检测结果见表8。由此可以看出，该组10个平行的检测结果RSD为16.53％和18.16％，符合要求(小于25％)。这说明本检测方法可以对单位体积GI、GⅡ型诺如病毒拷贝数为20的样品进行稳定的定量检测。

表8诺如病毒数字PCR的LOQ验证

取在线性范围验证中可以稳定扩增的最低浓度组进行LOD的验证。将该组样品进行10个平行的数字PCR验证，验证结果如表9所示。由此可以看出，十个平行中，阳性检出率为10个，符合LOD质控的要求(不低于9个)。这说明，本方法可以对拷贝数为6.6的核酸样品进行稳定检测。

表9诺如病毒数字PCR的LOD验证

5、诺如病毒数字PCR的精密度验证

取诺如病毒核酸LOQ、3倍LOQ、10倍LOQ和20倍LOQ浓度的DNA样品进行精密度验证，每个样品做3个平行。通过数字PCR对其拷贝数进行测定，要求每组的RSD值小于25％。

精密度是指在重复性的条件下，用相同的方法及测试项目，在同一实验室，由同一人员在很短的时间间隔内，使用相同的仪器设备得到的检测结果的标准差。

取LOQ、3倍LOQ、10倍LOQ和20倍LOQ浓度的核酸进行精密度验证，每个样品做3个平行。通过数字PCR对其拷贝数进行测定，检测结果见表10。由此可以看出，综合分析样品的检测结果，四组浓度的样品所得到的组内RSD值在2.86－23.59之间，符合整个方法对于精密度的要求(RSD小于25％)。

表10诺如病毒数字PCR标准的精密度验证

6、人工染毒样品病毒回收率计算及珠海地区贝类诺如病毒污染状况调查

在贝类样品中添加50倍LOQ的病毒然后进行核酸提取，利用本试验建立的数字PCR方法分别对贝类样品处理后所提取的病毒RNA和阳性标准品提取的病毒RNA进行检测，通过公式计算病毒回收率。

回收率公式：

对珠海地区贝类诺如病毒污染情况调查共收集贝类样品79份，部分来源于日常受理的法定检验和委托检验的贝类样品，部分来源于市场采购样品。所有样品均采用TRIzol经典方法提取核酸，分别采用数字PCR方法按上述反应体系及反应条件进行检测。

按2.2.9的方法对诺如病毒污染的贝类样品进行核酸提取和数字PCR方法检测，得到病毒核酸回收率约为60％，符合诺如病毒检测相关标准中对病毒核酸回收率的要求(＞10％)，本方法可用于贝类诺如病毒的检测。

利用本项目所建立的检测方法对实际样品进行检测，得到的结果如下表所示：共检测样品79个，其中检出诺如病毒GII型2个，未检出诺如病毒GI型。数字PCR的检测结果与荧光PCR检测结果一致。

表11珠海地区贝类样品污染调查结果汇总表

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。需注意的是，本发明中所未详细描述的技术特征，均可以通过本领域任一现有技术实现。

序列表

<110> 拱北海关技术中心

<120> 一种水产品诺如病毒GI型和GII型联合定量检测试剂盒

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ctcctaaatc tgccattgag t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

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<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

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<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

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<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

cggtgaacgc attccc 16

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

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