一种大曲中四甲基吡嗪合成关键基因表达的定量检测方法

摘要

本发明公开了一种大曲中四甲基吡嗪合成关键基因表达的定量检测方法，属于白酒检测技术领域。本发明采用实时荧光定量法检测大曲中四甲基吡嗪合成的关键基因（alsS基因和alsD基因）来检测四甲基吡嗪的含量变化。首先利用细菌总RNA快速抽提试剂盒提取大曲中的基因组RNA；再利用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（逆转录试剂盒）将RNA转化为cDNA；随后进行实时荧光PCR检测，即可完成四甲基吡嗪含量检测。本发明利用分子生物学手段，通过检测四甲基吡嗪合成关键基因alsS基因和alsD基因，实现对其进行实时定量检测，评估芽孢杆菌产乙偶姻、四甲基吡嗪的情况。且相较于普通PCR方法具有操作简便、速度快，具有产物检测和定量分析一体化等优点。

说明书

技术领域

本发明属于白酒检测技术领域，具体涉及一种大曲中四甲基吡嗪合成关键基因表达的定量检测方法。

背景技术

白酒中四甲基吡嗪是一种香气成分，具有坚果、烤面包、熟花生、榛子、可可豆的香味，是酱香型白酒和芝麻香型白酒的重要香气成份之一。同时，它具有扩张血管、改善血循环、控制血小板集聚、保肝护肝等临床药理作用，是中国白酒有益健康因子。近年来随着消费者对白酒的要求越来越高，不仅注重口感与质量，对白酒的健康因子也非常关注。研究提高白酒中的四甲基吡嗪含量不仅有益于增加白酒的健康元素，增加产品价值，也有利于促进白酒产业可持续发展。“曲为酒之骨”，曲药质量决定白酒的风格。在酱香型白酒中生产过程中，曲粮比为1:1，用曲量是中国白酒中最大的。大曲中的香气成分包括吡嗪类物质会进入到白酒中去，同时大曲中吡嗪的含量会决定整个白酒发酵过程中吡嗪的最终含量。

四甲基吡嗪是白酒中的健康因子之一，它作为中药材川穹根茎的主要活性生物碱成分，具有抗氧化、扩张血管、防止肝肺纤维化等多种生理作用，临床上已广泛应用于治疗心脑血管疾病、呼吸系统疾病、慢性肾功能衰竭疾病等并且取得了良好的疗效。四甲基吡嗪在各香型酒中含量的差别较大，与酿酒工艺特点有密切关系，高温的工艺特点有利于四甲基吡嗪的产生。基于酱香型白酒“四高两长”的生产工艺特点以及芝麻香型的高氮配料、高温堆积、高温发酵和长期贮存的工艺特点，使得四甲基吡嗪在酱香和芝麻香型白酒中含量最高，浓香型白酒次之，清香型白酒含量最少。但是，许多品牌的酱香型白酒中四甲基吡嗪含量仍然较低，有待进一步的研究。

关于四甲基吡嗪合成的机制目前有两种：（1）葡萄糖和氨基酸通过Maillard反应可以产生吡嗪类物质；（2）3-羟基丁酮和铵盐通过化学反应能够产生四甲基吡嗪，且高温有利于反应的正向反应。江南大学通过现代风味化学、微生物学与代谢工程等技术手段，首次证实了中国白酒中四甲基吡嗪产生途径：功能菌株糖降解产生丙酮酸，两分子的丙酮酸缩合生成α-乙酰乳酸，α-乙酰乳酸脱羧产生3-羟基丁酮，3-羟基丁酮与由氨基酸在氨基酸脱氢酶作用下产生的氨经过缩合反应生成四甲基吡嗪。因此，可以通过提高四甲基吡嗪的前提物质乙偶姻的含量来增加四甲基吡嗪的含量。然而人类、哺乳动物、植物、真核生物等都能产生乙偶姻，微生物是生物乙偶姻生产研究的核心领域。细菌发酵产生乙偶姻过程中的关键三种酶物质，乙酰乳酸合成酶(ALS)、2-乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)和2，3-丁二醇脱氢酶(BDH)。可以通过筛选高产乙偶姻的菌株、添加醋酸、高供氧、调节ph为6左右、控制温度等提高乙偶姻的含量，从而增加四甲基吡嗪含量。

近年来，核酸生物技术得到快速发展，能够实现生物体基因表达的定量。目前，用于基因成分检测的常用方法有普通PCR法、实时荧光定量PCR法、环介导等温扩增技术和滚环扩增等方法，其中实时荧光定量PCR法具有快速准确、简单可靠、自动化强等优点，被广泛用于作物育种、医疗等领域。实时荧光定量PCR是将普通PCR和光谱分析、实时检测等手段巧妙结合应用的一项技术，具备特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、自动化程度高等优点，已成为分子生物学领域的重要技术工具。尤其是在微生物检测方面得到极大的推广应用。传统微生物计数的方法并不能真实有效的反映发酵体系中微生物的种类和数量，并且缺乏感兴趣基因的表达信息，而实时荧光定量 PCR 的方法，则可以实时、快速、定量的对发酵体系中的微生物活性及基因表达进行跟踪检测。目前已有部分研究探究了单一菌株发酵与混菌发酵对大曲中四甲基吡嗪生成含量的影响，通过高效液相色谱法检测四甲基吡嗪的含量。在专利公开号为CN104007191A的专利文件中公开了一种测定白酒中四甲基吡嗪含量的方法，该方法利用高效液相色谱法对白酒中的四甲基吡嗪含量进行检测，耗时长、前期处理步骤繁琐、操作较复杂，无法实时监测发酵过程中四甲基吡嗪生成变化情况。在专利公开号为CN111363786A的专利文件中还公开了一种大曲霉菌生物量的定量检测方法，该方法将提取得到的微生物DNA进行荧光定量PCR检测，根据标准曲线计算霉菌生物量，实现了实时监测不同发酵时期大曲根霉生物量和毛霉生物量的变化趋势的效果。采用荧光定量PCR的方法有较理想的效果，并能够获取目标基因表达的准确定量信息，在白酒酿造关键物质检测中有广阔的应用前景和发展优势。 因此，有必要建立芽孢杆菌产四甲基吡嗪关键基因表达多重监控技术，实时监测高温制曲过程四甲基吡嗪变化情况。

建立芽孢杆菌产四甲基吡嗪关键基因表达多重监控技术，同时测定芽孢杆菌活菌量和多基因表达量。将其应用到高温大曲的发酵过程中，检测芽孢杆菌在大曲发酵过程中的活菌比列、活性以及产四甲基吡嗪关键基因表达变化情况，分析产生3-羟基-2-丁酮直接相关的alsS，alsD基因表达量和产四甲基吡嗪量的内在关系和影响机制。

发明内容

本发明的目的在于提供一种大曲中四甲基吡嗪合成关键基因表达的定量检测方法，以解决现有酿酒大曲检测技术存在漏检、检测复杂、反应条件要求高、难以大量推广的问题。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种大曲中四甲基吡嗪合成关键基因表达的定量检测方法，采用qPCR法检测促进乙偶姻生成的两种关键基因（alsS，alsD基因）的特定核酸序列。

本发明中，qPCR(Quantitative Real-time PCR），中文名字实时荧光定量PCR，其因为具有灵敏度高，检测线性范围宽，检测精度和重复性好等突出优势，被广泛应用在各个领域。将其应用在高温大曲制作过程中，可以准确、高效、实时监测发酵过程中四甲基吡嗪的变化情况。qPCR指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。此次实验使用的是荧光染料的方法，即在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步，该方法成本较低，适合大规模的实验。

作为优选地，该方法具体包括如下步骤：

（1）利用细菌总 RNA 快速抽提试剂盒提取大曲中的基因组RNA，并利用逆转录试剂盒将其转化为cDNA，进行下一步实验。

（2）特异性引物序列如下；

alsS基因特异性引物：

正向引物序列：TCTTTGGATAATGCGGCG

反向引物序列：TGCCCTGCTGACGCTATC

alsD基因特异性引物：

正向引物序列：GATCGGTTTTGACGGTGAG

反向引物序列：ATCGGCACATACGGTTTTTC

16S rRNA内参基因引物：

正向引物序列：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG

反向引物序列：AAGGAGGTGATCCACCC

（3）实时荧光PCR反应体系：总体积20μL，包括Fast SYBR Green Master Mix 10μL，上下游引物(10 µmol/L)各4μL，cDNA(25ng/μL) 2μL；

（4）实时荧光PCR反应程序：95℃预变性10 min，1个循环；95℃变性10 s，60℃退火30 s，45个循环，在60℃收集荧光信号；

（5）所述实时荧光PCR方法设置空白对照、阴性对照、阳性对照，判定标准为：

空白对照：以ddH

阴性对照：以非alsS基因和alsD基因cDNA为模板，按照所述实时荧光PCR反应体系和所述实时荧光PCR反应条件，进行实时荧光PCR反应，检测Ct值＞或＝40；

阳性对照：以alsS基因和alsD基因cDNA为模板，按照所述实时荧光PCR反应体系和所述实时荧光PCR反应条件，进行实时荧光PCR反应，检测Ct值＜或＝30；

待测样品alsS基因和alsD基因检测Ct值≥40，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，判定该样品未检出alsS基因和alsD基因；待测样品alsS基因和alsD基因检测Ct值≤36，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，判定该样品检出alsS基因和alsD基因；待测样品alsS基因和alsD基因检测Ct值在36~40之间，重做实时荧光PCR扩增，再次扩增后结果Ct值大于40且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，判定该样品未检出alsS基因和alsD基因；再次扩增后结果Ct值仍小于40且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，判定该样品检出alsS基因和alsD基因。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、利用分子生物学手段，通过检测四甲基吡嗪合成关键基因alsS基因和alsD基因，实现对其进行实时定量检测，评估芽孢杆菌产乙偶姻、四甲基吡嗪的情况。

2、采用实时荧光PCR方法，相较于普通PCR方法具有操作简便、速度快，具有产物检测和定量分析一体化等优点。

附图说明

图1是本发明实施原理图。

图2是本发明实施例检测地衣芽孢杆菌中关键基因（alsD基因）的荧光PCR扩增图。

图3是本发明实施例检测混菌发酵样品中关键基因（alsD基因）的荧光PCR扩增图。

图4是本发明实施例混菌发酵样品在不同发酵时期四甲基吡嗪含量变化情况。

具体实施方式

下面将对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。

需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。

下面的实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。

本发明的主要目的是提供一种大曲中四甲基吡嗪合成关键基因表达的定量检测方法，通过检测芽孢杆菌四甲基吡嗪合成关键基因（alsS基因和alsD基因）表达的定量检测方法。选择alsS基因和alsD基因作为对象，通过Primer Premier 5软件设计实时荧光PCR特异性扩增引物，本发明所用的实时荧光PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

alsS基因特异性引物：

正向引物序列：TCTTTGGATAATGCGGCG

反向引物序列：TGCCCTGCTGACGCTATC

alsD基因特异性引物：

正向引物序列：GATCGGTTTTGACGGTGAG

反向引物序列：ATCGGCACATACGGTTTTTC

16S rRNA内参基因引物：

正向引物序列：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG

反向引物序列：AAGGAGGTGATCCACCC

本发明的方法中所用材料如下：

材料：小麦粉，大曲粉，稻壳，均由四川某酱香型酒厂提供。

Bacillus licheniformis 16Sr RNA的基因序列如下所示：

gaggcgcgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc tggtagtgca cgccgtaaac 60

gaatgagtgc taagtgttag agggtttccc gcctttagtg ctgcagcaaa cgcattaagc 120

actccgcctg ggggagtacg gtcgcaagac tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc 180

acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac caggtcttga 240

catcctctga caaccctaga gatagggctt ccccttcggg ggcagagtga caggtggtgc 300

atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc 360

ttgatcttag ttgccagcat tcagttgggc actctaaggt gactgccggt gacaaaccgg 420

aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta cacacgtgct 480

acaatgggca gaacaaaggg cagcgaagcc gcgaggctaa gccaatccca caaatctgtt 540

ctcagttcgg atcgcagtct gcaactcgac tgcgtgaagc tggaatcgct agtaatcgcg 600

gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccacg 660

agagtttgta acacccgaag tcggtgaggt aaccttttgg agccagccgc cgaaggtggg 720

acagatgatt ggggtg 736

种子液培养基：酵母膏5 g，蛋白胨10 g，氯化钠10 g，pH中性，蒸馏水1L，121℃灭菌20 min。

固态发酵培养基：小麦粉与稻壳按10：1的比例混合，加入40%的蒸馏水润湿、混匀，平铺在蒸架上，汽蒸30 min左右，至不见生粉状态，冷却后分装到100 mL（装30 g）锥形瓶中，121℃灭菌20 min。

实验试剂： 细菌总 RNA 快速抽提试剂盒，购买于生物工程（上海）股份有限公司；Fast SYBR Green Master Mix、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit购买于赛默飞世尔科技（中国）有限公司；四甲基吡嗪标品（色谱纯98%）：北京谱析-盛世康普；乙偶姻标品（色谱纯），阿拉丁试剂公司；纳氏试剂，成都市科隆化学品有限公司。甲醇（色谱纯），无水乙醇，无水CaCl2等其他试剂均购于四川蜀都试剂公司。所有溶液均采用超纯水制备，超纯水通过Millipore Milli-Q净水系统（电阻>18.3 MΩ）（Millipore，Billerica，MA）获得。

实施例1

（1） 种子液培养

在无菌条件下，待液态培养基灭菌冷却至室温后，接种地衣芽孢杆菌至培养基中，37℃，140r/min培养48h。

（2） 提取RNA

取液态培养基中的地衣芽孢杆菌，利用细菌总 RNA 快速抽提试剂盒提取发酵物的基因组RNA，将提取的DNA溶解在100μL TE溶液中，置于-80℃冰箱保存、备用。

（3） 逆转录

将提取出来的RNA利用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒逆转录成cDNA，置于-80℃冰箱保存、备用。

（4）建立实时荧光反应体系：总体积20μL，包括Fast SYBR Green Master Mix 10μL，上下游引物(10 µmol/L)各4μL，cDNA(25ng/μL) 2μL。

（5）建立实时荧光反应程序：95℃预变性10 min，1个循环；95℃变性10 s，60℃退火30 s，45个循环，在60℃收集荧光信号。

（6）检测结束后，根据扩增曲线和Ct值判定结果。

（7）所述确定质量控制指标是：

空白对照：以ddH

阴性对照：以非alsS基因和alsD基因cDNA为模板，按照所述实时荧光PCR反应体系和所述实时荧光PCR反应条件，进行实时荧光PCR反应，检测Ct值＞或＝40；

阳性对照：以alsS基因和alsD基因cDNA为模板，按照所述实时荧光PCR反应体系和所述实时荧光PCR反应条件，进行实时荧光PCR反应，检测Ct值＜或＝30；

（8）结果判定

待测样品alsS基因和alsD基因检测Ct值≥40，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，判定该样品未检出alsS基因和alsD基因；

待测样品alsS基因和alsD基因检测Ct值≤36，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，判定该样品检出alsS基因和alsD基因；

待测样品alsS基因和alsD基因检测Ct值在36~40之间，重做实时荧光PCR扩增，再次扩增后结果Ct值大于40且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，判定该样品未检出alsS基因和alsD基因；再次扩增后结果Ct值仍小于40且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，判定该样品检出alsS基因和alsD基因。

（9）检测结果与分析：

作为优选，本实施例荧光定量PCR仪为ABI QS3荧光定量PCR仪。

本实施例在特异性和灵敏度验证实验中，荧光PCR反应都重复三次，表示结果的Ct值表示每个反应管内荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数，取三次结果的平均值；SD表示标准差。

图2从左到后分别表示16SrRNA内参基因、芽孢杆菌和空白组。由图可知，在16SrRNA内参基因的稳定表达下，地衣芽孢杆菌经过培养基活化后会产生生成促进乙偶姻合成的关键基因（alsD基因）。

实施例2

（1） 模拟工厂制曲发酵

在无菌条件下，待固态培养基灭菌冷却至室温后，接种1 mL芽孢杆菌种子液至培养基中；每组实验设置三个平行。模拟工厂制曲的温湿度变化，发酵条件为：1-2天，30℃，90%RH；3-4天，37℃，95%RH；第5-6天，45℃，95%RH；第7天，55℃，95%RH；第8天，65℃，95%RH。

（2） 提取RNA进行逆转录获得cDNA

取部分模拟大曲发酵的固态培养基中的发酵物，利用细菌总 RNA 快速抽提试剂盒提取发酵物的基因组RNA，将提取的DNA溶解在100μL TE溶液中，置于-80℃冰箱保存、备用。将提取出来的RNA利用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒逆转录成cDNA，置于-80℃冰箱保存、备用。

（3） 进行实时荧光定量检测

总体积20μL，包括Fast SYBR Green Master Mix 10μL，上下游引物(10 µmol/L)各4μL，cDNA(25ng/μL) 2μL。95℃预变性10 min，1个循环；95℃变性10s，60℃退火30 s ，45个循环，在60℃收集荧光信号。

（4） 四甲基吡嗪含量检测

样品前处理：用100mL锥形瓶称取样品10 g，再加入0.1g无水氯化钙，30mL 60%的乙醇，进行超声20分钟。取上清液8000r/min离心10min。离心后的上清液转移到另一离心管中，放在-20℃冰箱内保存。

液相色谱方法：色谱柱：Agilent TC- C18；检测器：VWD检测器；检测波长278nm；流动相：水溶液(0.05％三氟乙酸):甲醇=3:7；流速1mL/min。

四甲基吡嗪标准曲线的绘制：用体积分数为57％的乙醇溶液将四甲基吡嗪标准品分别配制成5、10、20、30、40mg/L的浓度，以浓度和峰高绘制标准曲线。

（5） 检测结果与分析

图3从左到后分别表示为16SrRNA内参基因、发酵第9天、第7天、第5天、第3天和第1天的关键基因的荧光PCR扩增图。由图可知，以16SrRNA为内参基因，对关键基因alsD进行检测，随着发酵时间的增加，关键基因的CT值减少，说明体系中的关键基因（alsD基因）含量增加，两者呈正相关关系。利用混菌体系进行大曲发酵，有利于关键基因含量的提高，更好的生成四甲基吡嗪，提高大曲的质量与香气。根据图4我们可以知道，随着发酵时间的增加，样品中的四甲基吡嗪含量也随之增加，两者呈正相关关系。将实时荧光定量检测结果与四甲基吡嗪含量进行对比分析，发现两者呈正相关关系，当体系中产生四甲基吡嗪的关键基因变多的时候，四甲基吡嗪含量也随之增加。

上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。