一种快速鉴定荣昌猪肉的方法和试剂盒

摘要

本发明属于分子生物学应用技术领域，具体涉及一种快速鉴定荣昌猪肉的方法和试剂盒。所述方法为通过竞争PCR扩增检测荣昌猪肉miRNA‑182基因上的高频G/A突变，所获得的产物为两条大小不同的片段，以此来鉴定荣昌猪肉的真伪。本发明的鉴定方法为针对荣昌猪肉真伪鉴别的高效特异性方法，可准确鉴别出假冒荣昌猪肉，或使用鸭肉鸡肉等其他动物源性成分或大豆成分假冒的猪肉制品，操作方便快捷准确，便于基层监管部门和企业的快速鉴别假冒品牌猪肉使用。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学应用技术领域，具体涉及一种快速鉴定荣昌猪肉的方法和试剂盒。

背景技术

荣昌猪是是我国三大地方良种之一，现已列为国家级畜禽重点保护品种。荣昌猪肉质好，商业价值高，深受消费者欢迎。由于国内猪肉价格出现较大幅度的波动，特别是以地方猪为原料的优质猪肉价格不断上涨，市场上猪肉掺假现象也层出不穷。有的不良商贩用便宜的鸭肉冒充五花肉。有的不良商家用大豆粉添加大量香精制成“肉粉松”，冒充纯猪肉制成的肉松销售。用普通猪肉冒充品质优良的品牌猪肉更是屡见不鲜。而长久以来，市面上缺乏荣昌猪肉真伪鉴别的检测技术方法，市场监督管理缺乏必要的技术支持。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种快速鉴定荣昌猪肉的方法，本发明目的之二在于提供一种快速鉴定荣昌猪肉的的试剂盒。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种快速鉴定荣昌猪肉的方法，所述方法为通过基因扩增技术鉴定荣昌猪肉miRNA-182基因上的高频G/A突变，所述荣昌猪肉miRNA-182基因序列为SEQ ID NO.1。

作为优选的技术方案之一，所述基因扩增技术为竞争PCR扩增。

作为优选的技术方案之一，所述竞争PCR扩增所用引物包括1条通用上游引物和2条竞争性下游引物。

作为优选的技术方案之一，所述竞争PCR扩增的产物为两条大小大小不同的片段。

作为优选的技术方案之一，所述的通用上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO.2，所述竞争性下游引物中内侧引物核苷酸序列为SEQ ID NO.3，外侧引物核苷酸序列为SEQ IDNO.4。

作为优选的技术方案之一，所述竞争PCR扩增包括如下步骤：

1)制备待检样本的DNA样本作为扩增模板；

2)利用权利要求5中所述的引物进行竞争PCR扩增；

3)在PCR反应完毕后直接进行琼脂糖凝胶电泳检测，产物片段为182bp和295bp的是荣昌猪肉，仅有295bp片段的是普通猪肉，没有任何阳性产物条带的是非猪肉样品。

作为优选的技术方案之一，所述竞争PCR扩增体系为：ddH

作为优选的技术方案之一，所述竞争PCR反应条件为：94℃，预变性5min；94℃45s，58℃45s，72℃1min，共33个循环；最后72℃延伸10min。

2、一种快速鉴定荣昌猪肉的试剂盒，所述试剂盒包括所述通用上游引物和竞争性下游引物。

作为优选的技术方案之一，所述试剂盒还包括dNTP、连接酶及相应的缓冲液。

本发明的有益效果在于：

本发明的鉴定方法为针对荣昌猪肉真伪鉴别的高效特异性方法，可准确鉴别出假冒荣昌猪肉，或使用鸭肉鸡肉等其他动物源性成分或大豆成分假冒的猪肉制品，操作方便快捷准确，便于基层监管部门和企业的快速鉴别假冒品牌猪肉使用。

附图说明

图1为竞争PCR原理示意图。

图2为竞争PCR检测扩增特异性实验结果图。泳道M为DNAmarker DL2000；泳道1-2为荣昌猪肉；泳道3-4为恩施黑猪肉；泳道5-6为大白猪肉；泳道7-8为鸡肉；泳道9-10为鸭肉；泳道11-12为草鱼肉；泳道13-14为牛肉；泳道15-16为羊肉；泳道17-18为黄豆；泳道19-20为绿豆；泳道21-22为黑豆；泳道23-24为不加模板的阴性对照。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

实施例1

1、竞争PCR反应扩增原理

竞争PCR扩增原理如图1所示，分析NCBI上荣昌猪全基因组序列，发现荣昌猪的miRNA-182基因序列(SEQ ID NO.1)有个高频的G/A突变，而该位点在其他猪种中相对高度保守。因此，针对荣昌猪的miRNA-182基因上下游序列分别设计通用上游引物和竞争性下游外侧引物，下游外侧引物在3'末端-3位点人为引入一个错配A。并针对荣昌猪miRNA-182 基因上高频突变位点G→A设计1条竞争性下游内侧引物，内侧引物3'末端T与突变位点A 互补，并在内侧引物3'末端-2位点人为引入一个错配A。

miRNA-182基因序列：下划线加粗部分为G→A突变位点

TCGCACCGTTTTTGGCAATGGTAGAACTCACACTGGTGAGATAATGGGATCCGGTGGTTCTAGACTTGCCAACTATGGTGC

上游引物RC-F：5'TAACTGTCGCTGCCTCTTCT 3'(SEQ ID NO.2)；

下游内侧引物RC-N：5'GCAGAGTTGCTTGCTGAGCCATT 3'(SEQ ID NO.3)；

下游外侧引物RC-W：5'ACTGTGTGTCACTTCCAGATGC 3'(SEQ ID NO.4)；

上游引物和下游内侧引物引发的PCR反应可产生182bp的产物。上游引物和下游外侧引物引发的PCR反应可产生295bp的产物。荣昌猪肉因为具有miRNA-182基因高频突变位点 G→A，可以和内外侧引物同时结合，产生2种PCR产物。而其他类型猪肉因不具备这个突变位点，只能和外侧引物特异性结合，产生295bp的产物。非猪肉类样本则不产生任何一种PCR产物。

2、竞争PCR反应扩增

将肉类样品切成小块，放入均质袋，内加入生理盐水，用拍击式均质器拍打5-8min。豆类样品在冰上用研钵研磨成细粉。用商业试剂盒提取样本的DNA样本作为扩增模板，竞争PCR扩增体系如下：

反应条件为：94℃，预变性5min；94℃45s，58℃45s，72℃1min，共33个循环；最后72℃延伸10min。反应结束后，取5μL反应液进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳胶中加入Goldview进行染色。电泳结束后在紫外投射仪下观察拍照。

结果如图2所示，仅有荣昌猪肉能扩增出2种PCR产物，其他种类猪肉能扩出一种PCR 产物，其他种类肉和豆类样品均未能扩增。结果表明，本发明方法对检测和区分荣昌猪肉有良好的特异性。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 重庆市畜牧科学院

武汉轻工大学

<120> 一种快速鉴定荣昌猪肉的方法和试剂盒

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 84

<212> DNA

<213> 天然序列(Natural Sequence)

<400> 1

tcgcaccgtt tttggcaatg gtagaactca cactggtgag ataatgggat ccggtggttc 60

tagacttgcc aactatggtg cgag 84

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

taactgtcgc tgcctcttct 20

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcagagttgc ttgctgagcc att 23

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

actgtgtgtc acttccagat gc 22