嗜黏蛋白艾克曼氏菌在制备β-鹅脱氧胆酸抑制剂中的应用

摘要

本发明涉及一种嗜黏蛋白艾克曼氏菌在制备β‑鹅脱氧胆酸抑制剂中的应用。经研究发现，嗜黏蛋白艾克曼氏菌能够通过降低血清胆汁酸β鹅脱氧胆酸水平，增加胰岛素分泌能力，提高FGF15/19的表达水平，促进糖原合成和降低糖异生，改善糖耐量，并且嗜黏蛋白艾克曼氏菌是健康肠道中正常存在的微生物，可长期摄入，安全性高。因此，嗜黏蛋白艾克曼氏菌可以作为鹅脱氧胆酸抑制剂，可开发出安全性高的改善糖耐量的药物或保健品。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种嗜黏蛋白艾克曼氏菌在制备β-鹅脱氧胆酸抑制剂中的应用。

背景技术

2型糖尿病代谢障碍包括周围组织胰岛素抵抗、肝脏葡萄糖生成增加和胰岛素分泌减少。虽然糖尿病的发病机制非常复杂，但胰岛β细胞相关的病理生理机制始终是糖尿病患病的核心环节。各种因素导致的胰岛β细胞破坏、细胞数量减少和功能减退最终都会引起血糖升高，从而引发糖尿病。因此保护和恢复胰岛β细胞功能成为治疗2型糖尿病的关键。

2型糖尿病是一种异质性疾病，其临床治疗途径往往是随着时间的推移逐步添加降糖药物，最终当胰岛β细胞功能严重下降时进行胰岛素治疗。目前临床应用的降糖药物种类很多，主要包括促进胰岛素分泌和增加胰岛素敏感性的药物。药物的合理选择可使胰岛β细胞功能得到最大限度的保护，如二甲双胍通过抑制氧化应激、内质网应激及VDAC1离子通道蛋白的活性等改善患者的胰岛β细胞功能。而胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂可以减轻体质量，并且增加胰岛β细胞的质量、抑制β细胞的凋亡，对于肥胖的糖尿病患者，强化治疗时，加用胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂可以在改善血糖的同时减轻胰岛素治疗所产生的负面影响。

嗜黏蛋白艾克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)是一种在2004年于人体肠道中分离出来的菌种，在人类消化道中普遍存在，约占比3％～5％。与其他肠道菌不同的是，嗜黏蛋白艾克曼氏菌可以储备黏蛋白，即使在肠道中没有营养物质(特别是在禁食期间)，也可以蓬勃地繁衍生息。经研究发现，嗜黏蛋白艾克曼氏菌有延缓衰老、抑制神经退行性疾病的作用。

发明内容

本发明经过研究发现，嗜黏蛋白艾克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)能够通过降低血清胆汁酸β-鹅脱氧胆酸(βCDCA)水平，增加胰岛素分泌能力，提高小肠成纤维细胞生长因子15/19(FGF15/19)(人FGF19与小鼠的FGF15同源)的表达水平，促进糖原合成和降低糖异生，改善糖耐量，并且嗜黏蛋白艾克曼氏菌是健康肠道中正常存在的微生物，可长期摄入，安全性高。因此，嗜黏蛋白艾克曼氏菌可以作为鹅脱氧胆酸抑制剂，可开发出安全性高的改善糖耐量的药物或保健品。

基于此，本发明提供了一种嗜黏蛋白艾克曼氏菌在制备β-鹅脱氧胆酸抑制剂中的应用。

此外，还提供了一种β-鹅脱氧胆酸抑制剂在制备小鼠FGF15基因表达促进剂或人FGF19基因表达促进剂中的应用。

在其中一个实施例中，所述嗜黏蛋白艾克曼氏菌的保藏号为DSM 22959。

在其中一个实施例中，所述β-鹅脱氧胆酸抑制剂包括活性成分，所述活性成分包括所述嗜黏蛋白艾克曼氏菌。

在其中一个实施例中，所述β-鹅脱氧胆酸抑制剂还包括辅料，所述辅料包括稳定剂，所述稳定剂选自焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、维生素C、半胱氨酸、抗坏血酸钠盐、异抗坏血酸钠盐、L-半胱氨酸盐酸盐和依地酸盐中的至少一种。

在其中一个实施例中，所述辅料还包括填充剂，所述填充剂选自微晶纤维素、乳糖、淀粉、预交化淀粉、甘露醇和山梨醇中的至少一种。

在其中一个实施例中，所述辅料还包括粘合剂，所述粘合剂选自羟丙纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、聚维酮和交联聚维酮中的至少一种。

在其中一个实施例中，所述辅料还包括崩解剂，所述崩解剂选自羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯比咯烷酮、交联羧甲基纤维素纳和干淀粉中的至少一种。

在其中一个实施例中，所述辅料还包括润滑剂，所述润滑剂选自硬脂酸镁、滑石粉、微粉硅胶和富马酸硬脂酸钠中的至少一种。

一种β-鹅脱氧胆酸抑制剂在制备胰岛素分泌促进剂或人FGF19基因表达促进剂中的应用。

在其中一个实施例中，所述β-鹅脱氧胆酸抑制剂包括嗜黏蛋白艾克曼氏菌。

嗜黏蛋白艾克曼氏菌在制备胰岛素分泌促进剂中的应用。

附图说明

图1为对照组、HS-water组、HS-hk AKK组和HS-AKK组小鼠体重的统计结果；

图2为对照组、HS-water组、HS-hk AKK组和HS-AKK组小鼠肠道嗜黏蛋白艾克曼氏菌含量的统计结果；

图3为对照组、HS-water组、HS-hk AKK组和HS-AKK组小鼠葡萄糖耐量的情况；

图4为在对照组、HS-water组、HS-hk AKK组和HS-AKK组小鼠体内经葡萄糖刺激后胰岛素分泌的情况；

图5为对照组、HS-water组、HS-hk AKK组和HS-AKK组小鼠胰岛细胞在体外在给予不同浓度葡萄糖刺激后，胰岛素分泌的统计结果；

图6为对照组、HS-water组、HS-hk AKK组和HS-AKK组小鼠体内胰岛素耐量的情况；

图7为对照组、HS-water组、HS-hk AKK组和HS-AKK组小鼠血清中βCDCA水平的统计结果；

图8为胰岛细胞系MIN6细胞在βCDCA处理后对不同浓度葡萄糖刺激的胰岛素分泌的统计结果；

图9为对照组、HS-water组、HS-hk AKK组和HS-AKK组小鼠在给予嗜黏蛋白艾克曼氏菌后小肠组织FGF15基因mRNA表达情况；

图10为对照组、HS-water组、HS-hk AKK组和HS-AKK组小鼠在给予嗜黏蛋白艾克曼氏菌后肝糖原含量的统计结果；

图11为对照组、HS-water组、HS-hk AKK组和HS-AKK组小鼠在给予嗜黏蛋白艾克曼氏菌后糖异生相关基因mRNA的表达情况；

图12为肠细胞系LS174T细胞在不同浓度βCDCA处理后FGF19基因mRNA表达情况。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

肝脏是合成胆汁酸的器官，胆汁酸在肝脏中由胆固醇合成，合成的途径包括胆固醇7α-羟化酶(CYP7A1)介导的经典途径和甾醇27-羟化酶(CYP27A1)介导的替代途径。在正常条件下至少75％的胆汁酸通过经典途径产生，经典途径主要产生鹅脱氧胆酸(CDCA)和胆酸(CA)，而替代途径主要产生CDCA。胆汁酸按照来源分为初级胆汁酸和次级胆汁酸：在肝脏中由胆固醇生成的CA和CDCA及其与甘氨酸或牛磺酸结合的产物为初级胆汁酸，在肠道菌的作用下，初级胆汁酸转变为脱氧胆酸(DCA)和石胆酸(LCA)为次级胆汁酸。

βCDCA和CDCA均是存在于人体内的初级胆汁酸，但βCDCA与CDCA的结构不同，具体为二者甾环3号手性碳的立体构型不同，βCDCA的甾环3号位上的碳是S构型，CDCA的甾环3号位上的碳R构型，βCDCA与CDCA是非对映异构体，目前βCDCA研究较少，功能还未知。

本申请的发明人经过研究发现，嗜黏蛋白艾克曼氏菌(Akkermansiamuciniphila)能够降低血清中初级胆汁酸β-鹅脱氧胆酸(βCDCA)的水平，而βCDCA可以抑制胰岛素分泌水平。因此，嗜黏蛋白艾克曼氏菌可以通过降低βCDCA的含量，来增加胰岛素分泌能力，促进糖原合成和降低糖异生，改善糖耐量。基于此，本发明一实施方式提供了一种嗜黏蛋白艾克曼氏菌在制备β-鹅脱氧胆酸抑制剂中的应用。

在本实施方式中，嗜黏蛋白艾克曼氏菌为德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)保藏号为DSM 22959的菌。嗜黏蛋白艾克曼氏菌是从健康成人的肠道中分离得到的益生菌，是健康肠道中正常存在的微生物，安全性高，可长期摄入，并且嗜黏蛋白艾克曼氏菌在肠道中的定植力强。经验证，通过补充嗜黏蛋白艾克曼氏菌可以降低血清中βCDCA水平，增加胰岛素分泌量。

具体地，上述β-鹅脱氧胆酸抑制剂包括活性成分，活性成分包括嗜黏蛋白艾克曼氏菌。可以理解的是，在其他实施方式中，活性成分还可以包括除嗜黏蛋白艾克曼氏菌的其他物质。

可选地，上述β-鹅脱氧胆酸抑制剂中还包括辅料。例如稳定剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂及矫味剂等。

在一些实施例中，辅料包括稳定剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂及矫味剂中的至少一种。具体地，稳定剂用于维持β-鹅脱氧胆酸抑制剂的稳定，保持其活性成分的有效性。具体地，稳定剂选自焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、维生素C、半胱氨酸、抗坏血酸钠盐、异抗坏血酸钠盐、L-半胱氨酸盐酸盐和依地酸盐至少一种。在其中一个可选地具体示例中，稳定剂选自焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、维生素C、半胱氨酸、抗坏血酸钠盐、异抗坏血酸钠盐、L-半胱氨酸盐酸盐或依地酸盐。当然，在其他实施例中，稳定剂不限于上述，还可以是其他能够维持β-鹅脱氧胆酸抑制剂稳定，使其活性有效即可。

具体地，填充剂用于增加β-鹅脱氧胆酸抑制剂的重量，利于试剂成型。可选地，填充剂选自微晶纤维素、乳糖、淀粉、预交化淀粉、甘露醇和山梨醇中的至少一种。在一个可选地具体示例中，填充剂为微晶纤维素、乳糖、淀粉、预交化淀粉、甘露醇或山梨醇。当然，在其他实施例中，填充剂不限于上述，还可以是其他可以食用的填充剂。

具体地，粘合剂起粘合作用。可选地，粘合剂选自羟丙纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、聚维酮和交联聚维酮中的至少一种。在一个具体的示例中，粘合剂为羟丙纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、聚维酮或交联聚维酮。当然，在其他实施例中，粘合剂不限于上述，还可以是其他可食用的具有粘合作用的物质。

具体地，崩解剂可以使得β-鹅脱氧胆酸抑制剂在胃肠液中迅速裂碎成细小颗粒的物质，从而使活性成分迅速溶解吸收。可选地，崩解剂选自羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯比咯烷酮、交联羧甲基纤维素纳和干淀粉中的至少一种。可以理解的是，在其他实施例中，崩解剂不限于上述，还可以是其他可以食用的具有崩解作用的物质。

具体地，润滑剂具有助流、抗粘和润滑的作用，利于β-鹅脱氧胆酸抑制剂的制备。可选地，润滑剂选自硬脂酸镁、滑石粉、微粉硅胶和富马酸硬脂酸钠中的至少一种。在一个具体地示例中，润滑剂为硬脂酸镁、滑石粉、微粉硅胶或富马酸硬脂酸钠。可以理解的是，在其他实施例中，润滑剂不限于上述，还可以是其他可以食用的具有润滑作用的物质。

具体地，矫味剂用于改善β-鹅脱氧胆酸抑制剂的口感。可选地，矫味剂选自甜味剂及芳香剂中的至少一种。可选地，甜味剂选自山梨糖、木糖、木糖醇、甘油、甘草酸二钠、甘露醇、甘露糖、半乳糖、麦芽糖、乳糖、果糖、甜精、糖精钠、甜菊糖甙、甜蜜素、葡萄糖、蔗糖及阿司帕坦中的至少一种；芳香剂选自小茴香油、玫瑰油、玫瑰香精、柠檬油、柠檬香精、香草香精、香草醛、香蕉香精、菠萝香精、木瓜香精、薄荷油、橙皮油、苹果香精、橘味香精及杏味香精中的至少一种。可以理解的是，在其他实施例中，矫味剂不限于上述，还可以是其他可以具有改善口感的物质。

当然，在其他实施例中，辅料不限于上述，还可以是其他能食用的辅料。

当然，上述β-鹅脱氧胆酸抑制剂的剂型没有特别限制。可选地，β-鹅脱氧胆酸抑制剂的剂型为颗粒剂、胶囊剂或片剂。

此外，本发明一实施方式还提供了一种嗜黏蛋白艾克曼氏菌在治疗2型糖尿病中的方法，该方法包括口服嗜黏蛋白艾克曼氏菌，其中，嗜黏蛋白艾克曼氏菌的剂量不低于1×10

另外，FGF15/19(是指小鼠FGF15基因或人FGF19基因的表达产物)是胆汁酸诱导的进食后期的肠道激素，其作用是降低肝脏的脂肪生成，促进从进食向禁食状态的代谢转化。研究表明FGF15/19是通过独立于胰岛素的途径刺激糖原合成并抑制糖异生。经本申请的发明人研究发现，β-鹅脱氧胆酸抑制剂通过对β-鹅脱氧胆酸的抑制还可以促进小鼠FGF15基因表达或人FGF19基因表达，从而刺激糖原合成并抑制糖异生。

因此，本发明一实施方式还提供了一种β-鹅脱氧胆酸抑制剂在制备胰岛素分泌促进剂、小鼠FGF15基因表达促进剂或人FGF19基因表达促进剂中的应用。具体地，β-鹅脱氧胆酸抑制剂为上文描述的任一实施例的β-鹅脱氧胆酸抑制剂。

此外，本发明一实施方式还提供了一种上述β-鹅脱氧胆酸抑制剂在制备非胰岛素途径的刺激糖原合成并抑制糖异生的产品中的应用。

另外，基于上述嗜黏蛋白艾克曼氏菌对胰岛素分泌的促进作用，本发明一实施方式还提供了一种嗜黏蛋白艾克曼氏菌在制备胰岛素分泌促进剂中的应用。

具体实施例

以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。以下实施例中使用的主要仪器包括动物天平、厌氧培养箱、离心机、罗氏LightCycler480荧光定量PCR仪、普通光学显微镜(Olympus公司，日本)。以下实施例中的嗜黏蛋白艾克曼氏菌购自德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)，保藏号为DSM 22959。附图中的“*”表示“P<0.05”，“**”表示“P<0.01”,“***”“P<0.001”；附图中的“control”代表对照组。

实施例1

(1)嗜黏蛋白艾克曼氏菌制备

嗜黏蛋白艾克曼氏菌(catalog No.22959,Type strain,DSMZ，德国)在添加0.5％(w/v，也即是100mL培养基含0.5g猪粘蛋白)猪粘蛋白(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)和0.05％(w/v，也即是100mL培养基含0.5g半胱氨酸)半胱氨酸(Sigma-Aldrich)的脑-心浸出液肉汤培养基(BD Bioscience,San Jose,CA)中进行厌氧培养。培养密度通过测量波长600nm处的吸光度计算。革兰氏染色检测培养纯度，用琼脂平板连续稀释法计数菌落形成单位(CFU)。嗜黏蛋白艾克曼氏菌于4℃，3000rpm离心30min，用无菌PBS洗涤2次，用含体积百分数为20％甘油的2mL厌氧无菌PBS重悬至5×10

(2)小鼠普通饲料或高蔗糖饲料及嗜黏蛋白艾克曼氏菌干预

8周龄的C57BL/J6品系小鼠(8周龄，雄性，体重几乎无差别)(中国南京大学南京生物医学研究所)饲养在特定的无病原体屏障设施中，置于单独通风的笼子中，每笼5只。小鼠被喂食普通饲料或高蔗糖饲料(HS)(含质量百分含量为42％的蔗糖)。采用HS饲料饲养的小鼠随机分为3组，分别为高蔗糖活嗜黏蛋白艾克曼氏菌组(HS-AKK)、高蔗糖热灭活嗜黏蛋白艾克曼氏菌组(HS-hk AKK)和高蔗糖普通饮用水组(HS-water)。其中：

HS-AKK组：高蔗糖饲料饲养，小鼠的饮用水中添加嗜黏蛋白艾克曼氏菌。具体为：将步骤(1)所得冻存菌复苏后进行扩增培养，将1mL收获的浓度为5×10

HS-hk AKK组：高蔗糖饲料饲养，小鼠的饮用水中添加与HS-AKK组等量的高温灭活嗜黏蛋白艾克曼氏菌，HS-hk AKK组小鼠的进水进食方式与HS-AKK组相同。高温灭活嗜黏蛋白艾克曼氏菌(hk-AKK)由步骤(1)中细菌浓度为5×10

HS-water组：高蔗糖饲料饲养，小鼠的饮用水中不添加任何物质，HS-water组小鼠的进水进食方式与HS-AKK组相同。

对照组：普通饲料饲养，饮用水中不添加任何物质。

对上述四组小鼠采用上述的方式饲养15周，每天更换饮用水。

(3)研究嗜黏蛋白艾克曼氏菌对胰岛素分泌的影响

在将各组小鼠饲养15周之后，进行如下检测：

1)测量各组小鼠的体重，结果如图1所示。

由图1可知，对照组小鼠体重高于HS-water组，HS-AKK组小鼠体重显著高于HS-water组小鼠，而HS-hk AKK组未见体重升高。

2)通过RT-PCR检测各组小鼠的粪便中嗜黏蛋白艾克曼氏菌的数量，结果如图2所示。

由图2可知，与普通饲料喂养的对照组小鼠相比，高糖饲料喂养的小鼠粪便中嗜黏蛋白艾克曼氏菌的数量显著减少；使用活嗜黏蛋白艾克曼氏菌进行治疗15周可以恢复高糖饮食导致的嗜黏蛋白艾克曼氏菌减少。

3)采用腹腔注射葡萄糖耐量试验检测各组小鼠对葡萄糖的糖耐量，结果如图3所示。

由图3可知，高糖饮食导致糖耐量受损，嗜黏蛋白艾克曼氏菌活菌的干预能显著提高葡萄糖耐量，而在热灭活的嗜黏蛋白艾克曼氏菌则无法提高葡萄糖的耐糖量。

4)采用葡萄糖刺激胰岛素分泌试验研究了嗜黏蛋白艾克曼氏菌在体内和体外对胰岛素分泌的影响及胰岛素耐量情况，结果如图4～图6所示。

由图4可知，在体内实验中，四组空腹胰岛素分泌无明显差异。在HS-AKK组，葡萄糖刺激后的胰岛素分泌恢复，然而HS-hk AKK组胰岛素分泌没有改善，葡萄糖刺激后胰岛素分泌紊乱。

由图5可知，在体外实验中，四组小鼠中分离出胰岛，高葡萄糖处理导致胰岛素释放显著增加，与对照组相比，HS-water组分离的胰岛则显示胰岛素释放受损。与体内实验结果一致的是，HS-AKK组分离的胰岛表现出葡萄糖刺激后的胰岛素分泌改善，而HS-hk AKK组分离的胰岛则没有这样的改变。

由图6可知，四组间胰岛素敏感性无显著差异。

综上图1～图6可知，高糖组胰岛素分泌明显受损但未出现胰岛素抵抗的小鼠模型，表现为嗜黏蛋白艾克曼氏菌数量减少，补充活的嗜黏蛋白艾克曼氏菌可以恢复胰岛素分泌并提高糖耐量。

(4)研究嗜黏蛋白艾克曼氏菌对小鼠血清胆汁酸的影响与胰岛素分泌的关系

1)检测各组小鼠血清中βCDCA的量以研究嗜黏蛋白艾克曼氏菌对小鼠血清胆汁酸的影响，结果如图7所示。

由图7可知，HS-water组的血清βCDCA水平明显高于对照组，而HS-AKK组的血清βCDCA水平显著降低。然而HS-hk AKK组并没有观察到βCDCA水平显著下降。

2)为了进一步研究βCDCA对于胰岛素分泌的作用，给予小鼠胰岛细胞系MIN6细胞βCDCA处理，检测胰岛素的分泌水平，结果如图8所示。

由图8可知，用葡萄糖刺激MIN6细胞可显著诱导胰岛素水平提高，葡萄糖联合βCDCA处理MIN6细胞可抑制葡萄糖诱导的胰岛素分泌，这表明嗜黏蛋白艾克曼氏菌可通过降低肠内βCDCA水平刺激胰岛素分泌。

(5)研究嗜黏蛋白艾克曼氏菌对FGF15/19基因的影响

人成纤维细胞生长因子19(FGF19)能通过独立于胰岛素的途径刺激糖原合成并抑制糖异生。为了研究嗜黏蛋白艾克曼氏菌对FGF15/19基因的影响，我们测定了各组小鼠肝组织中糖原合成情况、回肠中FGF15基因表达情况和糖异生相关基因的表达情况，结果如图9～图11所示。

由图9和图10可知，与喂食正常饲料的对照组小鼠相比，喂养高糖饲料的小鼠FGF15基因的mRNA水平显著降低，用嗜黏蛋白艾克曼氏菌活菌治疗可以恢复高糖饮食导致的FGF15基因水平下降。同时，高糖饮食显著降低了肝糖原含量，但用嗜黏蛋白艾克曼氏菌活菌处理后，肝糖原含量增加。由图11可知，嗜黏蛋白艾克曼氏菌能显著抑制糖异生作用。

综上图9～图11可知，嗜黏蛋白艾克曼氏菌能上调小鼠FGF15基因的表达。

为了研究βCDCA对于FGF19基因的表达的作用，我们给予肠细胞系LS174T细胞βCDCA处理，然后检测FGF19基因的mRNA表达水平，结果如图12所示。

由图12可知，FGF19基因的mRNA表达水平随βCDCA浓度的增加而降低，说明βCDCA可抑制FGF19基因表达。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。