一种利用组蛋白作为内参的免疫组织化学定量方法

摘要

本发明提供了一种利用组蛋白作为内参的免疫组织化学定量方法。该方法采用组蛋白家族作为免疫组织化学的内参蛋白，利用免疫组织化学法和图像处理软件对待测蛋白质进行定量分析；此外，该方法还包括分别对H3F3B和肿瘤标记物进行染色的步骤或采用双色免疫组化方法同时对H3F3B和肿瘤标记物进行染色的步骤。本发明提供的利用组蛋白作为内参的免疫组织化学定量方法，利用了组蛋白在组织的纵向和横向切面以及同一张切片的不同部位中的蛋白质水平的均一，可克服样品制备、抗原孵育条件、一抗和二抗孵化条件等因素上的差异，结果稳定且高度可重复性，将大大提高生命科学和免疫病理学中IHC标记定量的精确度。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种利用组蛋白作为内参的免疫组织化学定量方法。

背景技术

蛋白质参与许多生物过程，并在所有生物功能的最终执行者。许多蛋白质在疾病中其表达变化可以作为药物靶标或生物标志物。因此，精确测量和检测蛋白质表达对于充分描述这些功能至关重要。所以，蛋白质的检测和定量是极其重要的。传统的技术，如ELISA、免疫印迹(WB)、靶向质谱等推动了生物样品中的蛋白质检测和定量研究。此外，免疫组织化学(IHC)也是检测蛋白质及其在组织和细胞中的细胞定位和表达水平的重要方法。

其中，免疫组织化学通常用于外科和临床病理，因为它对于诊断和预测预后以及治疗反应至关重要。IHC也是一种简单有效的测定肿瘤标志物表达水平和细胞定位的方法，最近还用于检测用于个性化癌症治疗的预后和预测生物标志物(例如Her2和PD-L1)。但是，样品制备、IHC实验、分析后阶段中的许多参数都会影响最终结果。此外，IHC的结果通常由病理学家以非定量的方式进行评估，并根据染色强度和阳性表达的细胞率以及正确的细胞内定位情况给出评分，，因此其结果只是相对的而不是绝对的。

通常，由病理学家评估的Her2和PD-L1得分有助于选择患者的治疗方法，并且关于如何对Her2或PD-L1 IHC进行评分的许多建议或指导已公开，但是，由病理学家打分的结果存在着差异，甚至差异超过25％。虽然全自动免疫组织化学仪器、全侧面成像系统、数字图像分析软件的广泛应用，大大提高了IHC的定量，并且目前科研人员为了IHC结果的定量化做出了很多努力(例如，北欧免疫组织化学质量控制)，但是缺乏标准化和参考对照使得可重复性差仍然是一个主要问题。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种利用组蛋白作为内参的免疫组织化学定量方法。组蛋白家族的成员绝大多数定位于细胞核中，易于IHC定量；其在蛋白质类型的20种类型的人类癌组织中稳定且均匀地表达，并在肿瘤组织的纵向和横向及内部均匀表达，显示出其潜在的作用内部参考。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种利用组蛋白作为内参的免疫组织化学定量方法；该方法采用组蛋白家族作为免疫组织化学的内参蛋白，利用免疫组织化学法和图像处理软件对待测蛋白质进行定量分析。

进一步地，上述方法利用图像处理软件得到H-Score后，然后计算待测蛋白质H-Score与组蛋白H-Score的比值，进而对待测蛋白质进行定量分析。

进一步地，上述图像处理软件包括HALO数字病理图像软件。

进一步地，组蛋白选自H1F0、H2B和H3F3B中的一种。

进一步地，上述组蛋白为H3F3B。

进一步地，该方法包括分别对H3F3B和待测蛋白质进行染色的步骤。

进一步地，该方法包括采用双色免疫组化方法同时对H3F3B和待测蛋白质进行染色的步骤。

进一步地，该方法采用的H3F3B一抗的稀释比例为1：(200-800)。

进一步地，该方法采用的H3F3B一抗的稀释比例为1：400。

第二方面，本发明提供了组蛋白作为内参在采用免疫组织化学法对肿瘤标记物进行定量分析的方法中的应用。

进一步地，上述肿瘤标记物包括PGM1、Her2和PD-L1。

进一步地，上述方法包括分别对H3F3B和肿瘤标记物进行染色的步骤或采用双色免疫组化方法同时对H3F3B和肿瘤标记物进行染色的步骤。

第三方面，本发明提供了一种基于上述方法的对病理图像分析的软件，该软件包括获得待测蛋白质H-Score与组蛋白H-Score，然后计算二者比值的软件程序。

第四方面，本发明提供了一种利用组蛋白作为内参对待测蛋白质进行定量分析的试剂盒，该试剂盒包括上述方法在操作过程中使用的试剂和软件。本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明提供的利用组蛋白作为内参的免疫组织化学定量方法，利用了组蛋白在组织的纵向和横向切面以及同一张切片的不同部位中的蛋白质水平的均一，可克服样品制备、抗原孵育条件、一抗和二抗孵化条件等因素上的差异，结果稳定且高度可重复性，将大大提高生命科学和免疫病理学中IHC标记定量的精确度。

附图说明

图1显示了组蛋白家族作为IHC内参蛋白的可行性；其中，图a表示20种人类癌症组织的免疫组化图片；图b-d分别表示了在每种癌症组织切片中，H1F0、H2B和H3F3B的免疫组化评分；

图2显示了所选H3F3B抗体的特异性；其中，图a表示采用肝细胞性肝癌(HCC)样本验证所选H3F3B抗体的特异性的western blot结果；图b-d分别表示了采用0μg、5μg和15μgH3F3B抗原进行抗体吸收实验的结果；

图3显示了采用免疫组化方法对H3F3B定量的结果；其中，a为免疫组化后染色H3F3B的原始图片,b为HALO软件计算后的图像，c为采用HALO软件得到的阴性细胞数(0+细胞)和阳性细胞数(1+细胞，2+细胞，3+细胞)的统计结果图；

图4显示了采用不同稀释比例的抗体对肝癌细胞和癌旁肝组织染色结果以及免疫组化打分结果；其中，图a表示用不同稀释比例的H3F3B抗体对HCC组织染色的代表性图像；图b表示45例肝癌患者HCC组织的H-score结果代表图；图c表示了45例肝癌患者HCC组织中不同H3F3B抗体稀释比例下的H-score平均值；图d表示用不同稀释比例的H3F3B抗体对癌旁组织(Adj)染色的代表性图像；图e表示45例肝癌患者癌旁组织中的H-score结果代表图；图f表示了45例肝癌患者癌旁组织中不同H3F3B抗体稀释比例下的H-score平均值；

图5通过IHC染色结果显示了空间异质性不影响H3F3B蛋白质表达；其中，图a表示针对9名肝细胞癌患者的蜡块，每个蜡块切4张片子并采用H3F3B抗体对其进行染色的免疫组化打分结果；图b表示每个肿瘤切面的五个不同区域的H3F3B染色的免疫组化打分结果；图c表示同一张切片的五个肿瘤区域的H3F3B染色的免疫组化打分结果；

图6显示了H3F3B作为内参在其他标记物分析中的应用结果；其中，图a为分别在不同切片对PGM1和H3F3B进行染色的结果；图b表示图a中PGM1和H3F3B的H-Score评分比值；图c为分别在不同切片对Her2和H3F3B进行染色的结果；图d显示了Her2/H3F3B比值与病理医生打分结果的一致性；图e显示了病理医生打分结果与Her2/H3F3B比值的分布；图f为分别在不同切片对PD-L1和H3F3B进行染色的结果；图g显示了H-Score比值(PD-L1 H-Score/H3F3B H-Score)与PD-L1阳性细胞(R

图7显示了采用Her2和H3F3B的IHC双色染色对Her2在室内和室间定量的结果；其中，图a显示了采用Her2和H3F3B的IHC双色染色的图片；图b显示了第1天、第3天和外部实验室测试的H-Score比值(Her2 H-Score/H3F3B H-Score)结果的对比图；图c显示了Her2/H3F3B比值与病理医生打分结果的一致性；图d为用第一张切片分别在KFBio KF-PRO-005扫描仪和Hamamatsu Nano S60扫描仪扫描之后计算的Her2/H3F3B比值的对比图；

图8显示了DC-IHC的Her2/H3F3B比值和单独的染色的高度一致性。

具体实施方式

本发明提供了一种以组蛋白H3F3B作为内部参考标准品，通过IHC定量蛋白质表达水平的新方法，具有很高的准确性和可重复性。使用H3F3B作为内部参考，通过目前的方法(由病理学家评估的分数)以高一致性精确评估Her2和PD-L1表达水平。此外，本发明人还验证了H3F3B作为实验室内部和实验室之间的质量控制的可行性。

具体地，该利用组蛋白作为内参的免疫组织化学定量方法；该方法采用组蛋白家族作为免疫组织化学的内参蛋白，利用免疫组织化学法和图像处理软件对待测蛋白质进行定量分析。

在本发明一优选的实施方式中，上述方法利用图像处理软件得到H-Score后，然后计算待测蛋白质H-Score与组蛋白H-Score的比值，进而对待测蛋白质进行定量分析。

在本发明一优选的实施方式中，上述图像处理软件，包括但不限于，HALO数字病理图像软件。

在本发明一优选的实施方式中，组蛋白选自H1F0、H2B和H3F3B中的一种。

在本发明一优选的实施方式中，上述组蛋白为H3F3B。

在本发明一优选的实施方式中，上述方法包括分别对H3F3B和待测蛋白质进行染色的步骤。

在本发明一优选的实施方式中，上述方法包括采用双色免疫组化方法同时对H3F3B和待测蛋白质进行染色的步骤。

在本发明一优选的实施方式中，上述方法采用的H3F3B一抗的稀释比例为1：(200-800)。

在本发明一优选的实施方式中，上述方法采用的H3F3B一抗的稀释比例为1：400。

下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。

材料和试剂

1、患者和肿瘤组织

从肝癌或乳腺癌患者中采集了HCC、相邻肝组织样本和乳腺癌组织，并经东肝胆外科医院机构审查委员会批准(EHBH；批准编号：EHBHKY2014-03-006)。所有患者都获得书面知情同意。

2、试剂

在蛋白质免疫印迹(Western Blot)中采用的试剂：H3F3B抗体(浓度1：1000，兔多克隆抗体，GeneTex，GTX115549)，二抗：山羊抗小鼠IgG(H+L)-HRP结合物(浓度1：5000；使用#170-6516、Bio-Rad)，ECL试剂盒(ThermoFisher，#34905)。

在双色免疫组化(Dual-color immunohistochemistry，DC-IHC)实验中采用的试剂：H3F3B抗体(浓度1：50，小鼠单克隆抗体，正能生物，250011)，Her2抗体(浓度1：50；兔单克隆抗体，上海长岛抗体诊断有限公司，M-0196)；二抗采用碱性磷酸酶偶联山羊抗兔IgG(浓度1：100，博士德生物技术，BA1011)和山羊抗小鼠IgG(H+L)-HRP结合物(浓度1：100，Bio-Rad，170-6516)；DAB显色试剂盒(GK500710，基因科技)用于H3F3B染色，Fast-Red(ZLI-9045，ZSBG Bio)用于染色Her2。

通用方法

1、切片制备和免疫组化

由两名经验丰富的病理学家准确诊断HE染色结果后在对应的蜡块中预先标记病变；使用组织穿刺针将标记的组织中取直径为1.5mm的圆柱体，并放入预制备蜡块后制备组织芯片；组织芯片或常规切片的厚度为4μm，放置在用3-氨基丙基三乙氧基硅烷涂抹的切片上，90℃烤片1小时供IHC；二甲苯中脱蜡各10min，2次，然后采用梯度乙醇(100％、95％和85％各为5分钟)溶液水化；在pH 9.0的EDTA缓冲液中煮沸后，保持100℃10分钟(H3F3B，Her2，PGM1和DC-IHC)或20分钟(PD-L1)进行抗原修复，室温下冷却60分钟；利用3％H

2、免疫组织化学染色结果的扫描及计算

免疫组化染色结束后，利用扫描仪保存图像，包括KFBio KF-PRO-005(403WSIS、×40、0.238μm/像素)和Hamamatsu Nano变焦器S60(1832WSIs、×40、0.220μm/像素)。所有切片利用KFBIO KF-PRO-005-EX数字扫描仪进行扫描。使用HALO软件的Multiplex IHCv2.3.4HALO算法(Indica Labs)进行定量分析求H-Score，设置主要条件如下：H3F3B的DAB核(光密度)阳性阈值:0:0-0.099；1+:0.1-0.299；2+:0.3-0.499；3+:0.5-2.5；PGM1、Her2和PD-L1的光学密度为：0：0-0.099；1+：0.1-0.299；2+：0.3-0.499；3+：0.5-2.5。H-Score的计算方法如下：H-Score＝(1*1+细胞数)+(2*2+细胞数)+(3*3+细胞数)。

实施例1

本实施例验证组蛋白家族作为IHC内参蛋白的可行性，具体的操作过程和结果如下：

1、从Human Protein Atlas(https://www.proteinatlas.org/)网站下载IHC图像数据，并利用Halo软件(Indica Lab)分析了H1F0，H2B，H3F3B在20种人类癌症(乳腺癌、类癌、宫颈癌、结直肠癌、子宫内膜癌、胶质瘤、头颈癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌和尿路上皮癌)组织中的蛋白表达水平(每个患者的2个肿瘤部位)，结果如图1a-d。由图1可知，H1F0、H2B和H3F3B在20种人类癌症组织中稳定、均匀地表达，初步证明H1F0、H2B和H3F3B可以作为IHC的内参。

2、为了进一步证实组蛋白家族作为IHC内参的可行性，发明人利用Western Blot和抗体吸收试验验证所选H3F3B抗体的特异性：

2.1Western Blot：①取50mg肝癌组织提取蛋白样本，然后采用BCA蛋白定量试剂(碧云天)进行蛋白定量；②将提取的蛋白样本采用常规方法进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后转移至PVDF膜(Millipore)上；③将脱脂奶粉溶解在pH＝7.4的TBS-T缓冲液(0.05％(v/v)Tween 20/Tris-缓冲液)中得到无脂肪牛奶溶液，脱脂奶粉的浓度为5％(w/v)，将上述无脂肪牛奶溶液加入到上述蛋白样本中，1h后，加入一抗，4℃孵育过夜，用TBS-T洗膜3次后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，常温孵育1小时；④采用常规方法显色，分析，结果如图2a所示，H3F3B抗体识别17kDa(H3F3B对应的位置)的蛋白。

2.2抗体吸收实验：用梯度H3F3B抗原量(0μg，5μg，15μg，GTX115549-pro)分别与0.5μg H3F3B抗体(反应体系的体积为200μl，GTX115549)在4℃条件下反应过夜后，将H3F3B抗体作为一抗分别孵育3张连续切片，由于当H3F3B抗原过量时，这种已被抗原吸附的抗体不能再与组织内的抗原反应，故这种抗原吸附的抗体作为免疫组化一抗时，结果应为阴性，或阳性信号减弱；具体结果如图2b-d所示。由图2b-d所示，H3F3B抗原量为0μg时，免疫组化染色很强；H3F3B抗原量为5μg时，免疫组化染色显著减弱；H3F3B抗原量为15μg时，几乎没有被染色。

3、利用免疫组化方法对H3F3B染色，然后求H-score，结果图3。

实施例2

本实施例探究H3F3B抗体在作为IHC内参蛋白时的最佳稀释比例，具体的操作过程和结果如下：

将H3F3B抗体分别稀释至1/200、1/400和1/800倍(GTX115549)，对45对肝细胞癌和癌旁肝组织进行免疫组化染色直至不再深染后封片，于KFBio KF-PRO-005(403WSIs,×40,0.238μm/pixel)扫描仪进行扫描；利用HALO Multiplex IHC v2.3.4HALO algorithm(Indica Labs)求H-Score，绘图，结果如图4a和4b。

由图4a-b可知，IHC中采用的H3F3B抗体的合适稀释比例为1/400。

实施例3

本实施例探究H3F3B蛋白的表达是否受空间异质性的影响，具体的实验方法和步骤如下：

(1)取9例患者石蜡包埋组织，每块切第一张之后，以20um间隔再纵切3张后分别进行H3F3B染色直至不再深染后，扫描，于HALO软件计算H-Score，结果如图5a所示；

(2)取9例患者石蜡包埋组织，每例任意取5块组织(A，B,C,D,E)，每块切，切片后，对5个不同区域得到的切片分别进行H3F3B染色直至不再深染后，扫描，于HALO软件计算H-Score，结果如图5b所示；

(3)在切片的同一个切面上分别取5个不同区域，对5个不同区域的图片分别进行H3F3B染色直至不再深染后，扫描，于HALO软件计算H-Score，结果如图5c所示。

结果清晰地显示，H3F3B在4张切片中的变异系数(CV)值极小，最大CV为0.22％(图5a)，因此H3F3B的表达不受肿瘤纵向空间异质性的影响；此外，发明人选择每个肿瘤切面的五个不同区域的H3F3B染色进行了计算，并发现CV值仍然非常小，最大CV是0.21％(图5b)；H3F3B表达在同一张切片的不同肿瘤区域的表达也非常一致(图5c)，显示出H3F3B蛋白作为IHC内参的可能性。

实施例4

迄今为止，由于缺乏可量化的IHC内参，IHC肿瘤标记物的表达水平评价仍然处在只能半量性且可重复性差的现状。为了进一步评估H3F3B作为IHC定量的内参的可能性，本实施例利用PGM1(核和膜表达的典型代表)，Her2和PD-L1(膜表达的典型代表)等用于预测预后和指导治疗的IHC标记物，具体的操作方法和结果如下：

(1)分别对PGM1和H3F3B进行免疫组化直至不再深染(染色结果如图6a所示)后，扫描，计算H-Score后，求得PGM1/H3F3B比值，利用X-Tile软件计算最佳临界值后，利用SPSS软件做生存分析，结果如图6b。

结果显示，在285例中204例复发率较低，81例复发率较高，H-Score的比值0.16是判断复发可能的临界值。

(2)分别对Her2和H3F3B进行免疫组化直至不再深染(染色结果如图6所示)后，扫描，计算H-Score后，求得Her2/H3F3B比值，利用GraphPad软件绘图，比较与病理医生打分结果的一致性(图6d)。其中，如图6e所示，Her2和H3F3B的H-Score比值分为四类：(1)0和1+：0<比值≤0.028；(2)2+：0.13<比值≤0.36；和(3)3+：比值>0.44。

结果发现，H-Score的比值与病理学家的打分结果具有极高的一致性。

(3)分别对PD-L1和H3F3B进行免疫组化直至不再深染后，扫描，计算H-Score(图6f)后，求得PD-L1/H3F3B比值后与PD-L1阳性比例做了相关性分析(图6g)，并做了与病理医生打分结果的一致性观察，结果如图6h所示。

结果表明，H-Score比值(PD-L1 H-Score/H3F3B H-Score)与PD-L1阳性细胞(R

实施例5

本实施例采用双色免疫组化方法(DC-IHC)对Her2进行定量，具体的操作过程和结果如下：

H3F3B抗体和Her2抗体的混合液为一抗，二抗混合液采用碱性磷酸酶偶联山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG(H+L)-HRP结合物；敷完一抗和二抗后，先用Fast-Red染色Her2 15分钟后，冲洗2次，再用DAB检测试剂盒中的DAB试剂染色H3F3B直至不再深染后，封片；染色结果如图7a所示。

利用上述方法，采用3张连续切片，第一张为第一天染色，第二张为第三天染色，第三张为外部实验室染色，封片；扫描，计算H-Score后，求得Her2/H3F3B比值，结果如图7b所示；并做了与病理医生打分结果的一致性观察，结果如图7c所示；此外，用第一张切片分别在KFBio KF-PRO-005(403WSIs、×40、0.238μm/pixel)扫描仪和Hamamatsu Nano S60(1832WSIs、×40、0.220μm/像素)扫描仪扫描后做了Her2/H3F3B比值的对比(图7d)。

通过不同时间染色结果的比较以及室间染色结果的比较(图7b)显示，Her2/H3F3B比值恒定；病理医生打分结果与双染Her2/H3F3B比值的分布(图7c)显示，Her2和H3F3B的H-Score比值分为三类：Her2/H3F3B比值分为三类：(1)0和1+：0<比值≤0.1；(2)2+：0.19<≤0.44；和(3)3+：比值>0.46；通过不同的扫描仪扫描的结果(图7d)显示，Her2/H3F3B比值比较恒定。

此外，发明人将双色染色和实施例4中分别染色的Her2/H3F3B比值做了比较，结果如图8所示。结果发现，来自DC-IHC的Her2/H3F3B比值(图7b中第1天的数据)和单独的染色(图6d的数据)也高度一致。

综上所述，采用Her2和H3F3B的IHC双色染色方法，严格来说将H3F3B蛋白视为真正的内参，所以该方法是Her2定量极佳的室内质控和室间质控方法。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。