一种基于CRISPR-Cas12a系统的可视化病毒检测方法及应用

摘要

本发明公开一种基于CRISPR‑Cas12a系统的可视化病毒检测方法，所述方法通过将病毒基因组反转录或者直接进行PCR扩增获得dsDNA，即target DNA。设计特异靶向病毒基因的crRNA。当target DNA存在时，Cas12a‑crRNA特异识别目标DNA并激活Cas12a非特异ssDNase活性，降解连接AuNPs‑DNA探针的linker ssDNA，诱导AuNPs‑DNA聚集‑分散状态的改变，纳米金聚集‑分散状态的改变产生明显的颜色变化。该颜色变化可通过肉眼直接判断，也可通过智能手机App颜色识别器读取和分析检测结果。

说明书

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，尤其是一种基于CRISPR-Cas12a系统的可视化病毒检测方法及应用。

背景技术

病毒感染严重危害人类健康，病毒检测对于疾病的诊断、预防和治疗至关重要，开发有效、准确、快速以及灵敏的检测工具对于疾病控制有着至关重要的作用。尽管在实验室方面检测方法的开发已经取得了巨大的进步，但是仍然需要加强对于非实验室条件下的检测方法开发，尤其要推动现场检测方面(point-of-care testing,POCT)需要建立广泛的适用性。基于CRISPR-Cas的核酸检测技术为开发灵敏快速POCT检测提供了新颖的方式。目前，病毒的检测方法主要包含核酸检测、抗体检测、抗原检测。但是由于抗原检测检出率较低，目前新冠检测主要集中在抗体和核酸检测。其中核酸检测具有早期诊断、灵敏度和特异性高等特点，被认为是检测病毒感染的“金标准”；尽管核酸扩增测试(PCR/RT-PCR)是目前较早检测病原体的最敏感、最特异的方法，但是由于需要专门的实验室设备和训练有素的技术人员，不适合用于快速的及时诊断。此外，高传染性的病原体则需要实时监测，以便阻止它们在人与人之间的传播。而抗体检测操作便捷、检测迅速，可作为核酸诊断的补充手段，但由于抗体检测“假阳性”和“假阴性”的局限性，不适合用于复工复产复学等普通人群筛查，也不适用于在低流行地区的流行病学调查背景技术。

CRISPR-Cas(Clustered regularly interspaced palindromic repeat)系统是存在于大部分细菌和古细菌中的获得性免疫系统。成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)以及CRISPR相关(Cas)基因编码构成的RNA介导的免疫系统可以保护细菌和古菌免受病毒和外来DNA的入侵。近年，一些CRISPR-cas系统，包括Cas13a和Cas12a发现在crRNA(CRISPR RNA)识别靶标序列时具有非特异性的核酸切割活性(也称为反式切割)。这种反式切割活性为高灵敏度、高选择性的核酸检测提供了依据。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种基于CRISPR-Cas12a系统的可视化病毒检测方法及应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种基于CRISPR-Cas12a系统的可视化病毒检测方法，所述方法通过将病毒基因组RNA逆转录得到cDNA，DNA基因组不需要逆转录过程，再通过PCR扩增获得dsDNA，得到的产物称其为Target DNA，即目标DNA，设计特异靶向病毒基因序列的crRNA，利用Cas12a-crRNA复合物检测target DNA。

而且，所述病毒为新型冠状病毒SARS-CoV-2。

而且，具体步骤如下：

当Cas12a-crRNA检测到相应的Target DNA时，就能够切割荧光探针，使荧光基团FAM远离猝灭基团BHQ1，造成BHQ1对FAM荧光的猝灭被解除，FAM荧光值增加来检测新型冠状病毒SARS-CoV-2；此外，利用纳米金聚集颜色改变性质，纳米金颜色的深浅与Target RNA浓度，即新型冠状病毒基因组RNA的浓度具有线性关系，通过智能手机颜色识别器APP从而能够将新冠病毒基因组RNA的浓度即新型冠状病毒拷贝数转化成具体的数值输出。

而且，具体步骤如下：

target DNA存在时能够激发Cas12a-crRNA复合物的核酸特异性识别引发的附属切割能力，即切割无关单链DNA；在此情况下，若合成一条单链DNA，将其一端修饰荧光基团，另外一端修饰淬灭基团，制备成reporter DNA，即报告DNA，reporter DNA就能被Cas12a酶切，产生增强的荧光信号进行输出；此荧光信号的变化和待检测新型冠状病毒的浓度能够成线性关系，能够检测和定量新型冠状病毒；而纳米金显色实验中，linker-ssDNA序列的两端设计为可与纳米金颗粒交联的DNA序列，即DNA1/2-AuNPs互补配对；后续将Cas12a/crRNA系统与DNA1/2-AuNPs等体积混合，当linker-ssDNA被Cas12a降解时，DNA1/2-AuNPs保持分散状态从而呈现红色；其颜色的深浅可通过智能手机颜色识别器App灰度分析读取数值；灰度分析得到的数值和待检测新型冠状病毒的浓度能够成线性关系，能够检测和定量新型冠状病毒。

而且，具体步骤如下：

通过两步法来检测新型冠状病毒的RNA来得到target DNA，当Cas12a-crRNA检测到相应的target DNA时，即target DNA和crRNA能够互补配对，就能够切割荧光探针，使荧光基团FAM脱离猝灭基团BHQ1，造成BHQ1对FAM荧光的猝灭被解除，FAM荧光值增加能够与新型冠状病毒浓度成线性关系，能够特异性地检测和定量特定新型冠状病毒；此外，当linker-ssDNA被Cas12a降解时，DNA1/2-AuNPs保持分散状态从而呈现红色；其颜色的深浅可通过智能手机App颜色识别器灰度分析读取数值或者通过Tecan

而且，具体步骤如下：

(1)SARS-CoV-2质粒构建：合成含有新型冠状病毒N基因片段NC_045512.2的双链DNA，并通过BamHIandEcoR I酶切和T4 DNA连接酶链接构建到PLVX-AcGFP-N1慢病毒载体中，以获得SARS-CoV-2质粒，构建的质粒命名为lentiSARS-CoV-2-N的质粒；

合成的SARS-CoV-2基因片段序列信息(5’-3’)为SEQ ID NO.1：catcgtgttgtctgtactgccgttgccacatagatcatccaaatcctaaaggattttgtgacttaaaaggtaagtatgtacaaatacctacaacttgtgctaatgaccctgtgggttttacacttaaaaacacagtctgtaccgtctgcggtatgtggaaaggttatggctgtagttgtgatcaactccgcgaacccatgcttcagtcagctgatgcacaatcgtttttaaacgggtttgcggtgtaagtgcagcccgtcttacaccgtgcggcacaggcactagtactgatgtcgtaagctggacttccctatggtgctaacaaagacggcatcatatgggttgcaactgagggagccttgaatacaccaaaagatcacattggcacccgcaatcctgctaacaatgctgcaatcgtgctacaacttcctcaaggaacaacattgccaaaaggcttctacgcagaagggagcagaggcggcagtcaagcctcttctcgttcctcatcacgtagtcgcaacagttcaagaaattcaactccaggcagcagtaggggaacttctcctgctagaatggctggcaatggcggtgatgctgctcttgctttgctgctgcttgacagattgaaccagcttgagagcaaaatgtctggtaaaggccaacaacaacaaggccaaactgtcactaagaaatctgctgctgaggcttctaagaagcctcggcaaaaacgtactgccac

(2)SARS-CoV-2假病毒包装：将构建的含有SARS-CoV-2N基因和ORF1ab基因片段的质粒lentiSARS-CoV-2-N与psPAX2和pMD2.G质粒共转染到293T细胞中，转染48小时后，收集细胞培养上清，经过0.45μm滤膜过滤，获得含有SARS-CoV-2基因片段的慢病毒，即SARS-CoV-2假病毒；

(3)SARS-CoV-2N片段基因扩增：利用SARS-CoV-2特异的引物扩增N片段，扩增引物序列如下：

F：SEQ ID NO.2：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT

R：SEQ ID NO.3：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG

(4)将新型冠状病毒质粒转录得到RNA，将得到的RNA进行梯度稀释，梯度稀释的RNA逆转录得到cDNA，经过PCR扩增后的产物用于Cas12a/crRNA系统荧光检测；

(5)将新型冠状病毒质粒转录得到RNA，将得到的RNA进行梯度稀释，梯度稀释的RNA逆转录得到cDNA，经过PCR扩增后的产物用于Cas12a/crRNA系统联合纳米金显色检测；

(6)提取含有新型冠状病毒N基因片段的慢病毒RNA，将得到的RNA进行梯度稀释，梯度稀释的RNA逆转录得到cDNA，经过PCR扩增后的产物用于Cas12a/crRNA系统荧光检测；

(7)提取含有新型冠状病毒N基因片段的慢病毒RNA，将得到的RNA进行梯度稀释，梯度稀释的RNA逆转录得到cDNA，经过PCR扩增后的产物用于Cas12a/crRNA系统联合纳米金显色检测。

如权上所述的基于CRISPR-Cas12a系统的可视化病毒检测方法在微生物的检测方面中的应用。

如上所述的基于CRISPR-Cas12a系统的可视化病毒检测方法在新型冠状病毒的检测方面中的应用。

本发明的优点和积极效果如下：

1、本发明方法为一种基于CRISPR-Cas12a系统的检测的荧光检测方法和纳米金显色的方法，应用此方法仅需样品简单前处理、PCR扩增、荧光检测和纳米金显色4步，即可检测目的基因组RNA浓度，更重要的是，该方法只需改变核酸序列，即可以实现对不同微生物的检测，极大地拓宽了CRISPR-Cas12a在分子检测领域的应用。

2、本发明经过一系列实验建立起来CRISPR-Cas12a系统检测新型冠状病毒和结合纳米金显色检测新型冠状病毒通过智能手机App读取数值的方法，检测的标准曲线的相关系数R

3、本发明建立的检测方法检测限度低，最低检测限度为1copy/μL，并且在病毒10

4、本发明建立起来的检测方法特异性强，以检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)为例，对于SARS-CoV、MERS-CoV、MHV、IAV等微生物及新型冠状病毒没有明显的荧光增长，证明本发明对新型冠状病毒有良好的选择性，而受其他病原微生物影响。

5、本发明设计的荧光探针，不仅可以准确地检测新型冠状病毒，仅需要简单设计引物序列，即可用于检测其他病原体。该检测方法准确，检测范围较宽，方法简单快捷，易操作。

6、经过与其他传统检测方法的比较，本发明设计具有操作方法简单、灵敏度高等优点。同时与其他等温扩增方法(RPA、LAMP等)相比，本发明设计极大地缩减了检测成本，因此便于大宗样品的检测。

7、本发明方法基于CRISPR-Cas12a(LbCas12a)系统结合PCR扩增技术以高灵敏度和特异性检测新型冠状病毒并结合纳米金显色的方法可视化检测，同时，结合智能手机根据纳米金显色的颜色深浅读取数值，其检测限低至1copy/μL。此外，证明了该检测策略在复杂生物样品中检测新型冠状病毒的实际应用能力。并且为现场检测(POCT)提供了可能，该方法具有出色的可靠性、灵敏性、特异性和易于实施的特点，有望为海鲜样品中的新型冠状病毒的检测提供巨大潜力。

8、本发明中检测新型冠状病毒的方法的原理为：Cas12a-crRNA复合物仅当存在能与crRNA互补结合的特异性Target DNA存在时，才会激发Cas12a的附属切割活性，即可以切割其他的单链无关DNA(ssDNA)。若在无关DNA一端修饰FAM荧光基团，另外一端修饰淬灭集团BHQ1(即reporter RNA)时，就可以将切割效应转化为荧光信号输出。当Cas12a-crRNA检测到相应的Target DNA时，就可以切割荧光探针，使荧光基团FAM远离猝灭基团BHQ1，造成BHQ1对FAM荧光的猝灭被解除，FAM荧光值增加。简单地说，荧光值的变化与Target DNA浓度，即新型冠状病毒DNA(gDNA)的浓度成具有线性关系，从而可以将新型冠状病毒gRNA的浓度即新型冠状病毒拷贝数(copies/μL)转化成相应的荧光信号。此外，该研究开发的Cas12a/AuNPs检测平台，将Cas12a/crRNA系统与DNA1/2-AuNPs等体积混合，当linker-ssDNA被Cas12a降解时，DNA1/2-AuNPs保持分散状态从而呈现红色(阳性)，相反，当体系中没有病毒靶标序列时，Cas12a蛋白的ssDNase乱切活性无法被激活，完整的linker-ssDNA可使DNA1/2-AuNPs沉淀聚集，从而褪去红色。颜色深浅的变化与Target DNA浓度，即新型冠状病毒DNA的浓度成具有线性关系,而可以将新型冠状病毒基因组RNA的浓度即新型冠状病毒拷贝数(copies/μL)转化成酶标仪读取其OD值或者智能手机App读取数值。

9、本发明基于CRISPR-Cas12a纳米金显色的检测结果具有与实时PCR技术可比的敏感性和特异性，提供一种将基于CRISPR-Cas12a系统的超灵敏、高特异性、可视化、结合智能手机的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)检测方法，该方法能够为病原微生物检测提供了一种新思路，特别是新型冠状病毒(SARS-CoV-2)。

10、本发明方法首先对病毒进行预灭活预处理，提取其基因组RNA，通过M-MLV逆转录酶将RNA逆转录为cDNA，并进行PCR扩增得到双链DNA(double-strand DNA,dsDNA)，即target dsDNA。当target dsDNA存在时可以激发Cas12a-crRNA复合物的附属切割能力，即切割无关单链DNA(single DNA,ssDNA)。此ssDNA非特异切割一方面可以通过荧光信号检测，即一端修饰荧光基团，另一端修饰淬灭基团。当Cas12a-crRNA复合物检测到相应的Target DNA时，能够切割荧光探针，导致荧光值增加，荧光值的增长与待测病毒存在线性对应关系，从而来检测新型冠状病毒；另一方面，此ssDNA非特异切割可以通过金纳米显色检测，linker DNA与金纳米粒子表面结合的ssDNA1或ssDNA2碱基互补配对。即当target DNA存在时linker-ssDNA被Cas12a降解，DNA1-AuNPs和DNA2-AuNPs分开，无关单链DNA被切割，无法与金纳米粒子表面结合的DNA1和DNA2互补配对，那么金纳米粒子呈分散非聚集状态，金纳米溶液显示红色，离心后也为红色；当target不存在时，无关单链DNA不能被切割，其与DNA1和DNA2碱基互补配对，导致金纳米粒子聚集，颜色呈蓝紫色，离心后溶液上清呈无色。利用智能手机中“颜色识别器”APP可对金纳米溶液照片图像颜色进行读取并报告信号数值。目标病毒量越大，检测信号就越强。该方法具有极高的灵敏度，检测线低至1copy/μL，具有高特异性，能与其他冠状病毒和流感病毒区分，同时具备肉眼可视化，可结合智能手机读取信号，便于现场实时检测。

11、本发明利用CRISPR-Cas12a反式切割活性，设计了一种基于CRISPR-Cas12a结合金纳米粒子(AuNPs)可视化检测技术的智能手机集成生物传感器，可对SARS-CoV-2进行灵敏定量检测。它利用CRISPR-Cas12a在识别SARS-CoV-2特异性基因扩增子时进行linkerDNA反式切割，触发AuNPs的聚集-分散。颜色变化可通过肉眼和智能手机识别，用于SARS-CoV-2的半定量或定量现场检测。本发明设计的生物传感器应用到真实临床样本，阳性率和阴性率分别是100％和100％。本发明建立的该检测方法可高灵敏高特异可视化检测食品样本中的新型冠状病毒核酸。本发明中研究出使用CRISPR-Cas12a检测SARS-CoV-2的方法,这种检测方法与众不同之处在于开发了一款结合纳米金显色和智能手机APP软件直接读取检测数值，不需要复杂的仪器，就可以在实验室以外的环境中读出检测结果。

附图说明

图1为本发明中基于CRISPR-Cas12a系统应用于检测的SARS-CoV-2可行性分析图；

图2为本发明中基于CRISPR-Cas12a系统检测的选择性分析图；

图3为本发明中基于CRISPR-Cas12a系统对RNA浓度依赖性分析图；其中，3A：时间扫描图，3B：RNA浓度与荧光强度点线图；

图4为本发明中基于CRISPR-Cas12a系统检测新型冠状病毒基因组SARS-CoV-2的标准曲线图；其中，4A：时间扫描图，4B：新型冠状病毒基因组RNA浓度与荧光强度点线图，4C：qPCR法检测新型冠状病毒基因组扩增曲线，4D：qPCR法检测新型冠状病毒基因组柱状图分析；

图5为本发明中CRISPR-Cas12a系统检测SARS-CoV-2中结合纳米金检测的时间扫描图；其中，5A：可视化检测新型冠状病毒基因组SARS-CoV-2，5B：时间扫描图，5C：线性拟合标准曲线，5D：智能手机APP根据不同浓度新型冠状病毒基因组颜色深浅读取纳米金显色灰度图，5E：灰度分析曲线图，5F：灰度分析线性图；

图6为本发明中CRISPR-Cas12a系统检测猪肉样品中SARS-CoV-2的结果图；其中，6A：qPCR法检测猪肉中新型冠状病毒扩增曲线，6B：qPCR法检测猪肉中新型冠状病毒基因组柱状图分析，6C：CRISPR-Cas12a系统检测猪肉中新型冠状病毒基因组时间扫描图，6D：CRISPR-Cas12a系统检测猪肉中新型冠状病毒基因组荧光强度柱状图；6E：CRISPR-Cas12a系统结合纳米金可视化检测猪肉中新型冠状病毒基因组SARS-CoV-2显色图，6F：CRISPR-Cas12a系统结合纳米金检测猪肉中新型冠状病毒基因组SARS-CoV-2时间扫描图；6G：智能手机APP灰度分析图；

图7为本发明中Cas12检测新型冠状病毒与其他方法比较图；其中：7A：qPCR法，基于CRISPR-Cas12a系统荧光强度检测新型冠状病毒和CRISPR-Cas12a系统结合纳米金可视化检测新型冠状病毒三种方法热图比较，7B：qPCR法，基于CRISPR-Cas12a系统荧光强度分析法，检测新型冠状病毒和CRISPR-Cas12a系统结合纳米金可视化检测不同冷链中新型冠状病毒三种方法热图比较：7C：ROC曲线分析图，7D：韦恩图分析图；

图8为本发明中纳米金显色实验检测临床样本实验图；其中：8A：可视化检测临床样本中新型冠状病毒基因组阳性组；8B：可视化检测临床样本中新型冠状病毒基因组阴性组；8C：CRISPR-Cas12a系统结合纳米金时间扫描柱状分析图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所用各物质质量均为常规使用质量。

本发明中实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

一种基于CRISPR-Cas12a系统的可视化病毒检测方法，所述方法通过将病毒基因组RNA逆转录得到cDNA，DNA基因组不需要逆转录过程，再通过PCR扩增获得dsDNA，得到的产物称其为Target DNA，即目标DNA，设计特异靶向病毒基因序列的crRNA，利用Cas12a-crRNA复合物检测target DNA。

较优地，所述病毒为新型冠状病毒SARS-CoV-2。

较优地，具体步骤如下：

当Cas12a-crRNA检测到相应的Target DNA时，就能够切割荧光探针，使荧光基团FAM远离猝灭基团BHQ1，造成BHQ1对FAM荧光的猝灭被解除，FAM荧光值增加来检测新型冠状病毒SARS-CoV-2；此外，利用纳米金聚集颜色改变性质，纳米金颜色的深浅与Target RNA浓度，即新型冠状病毒基因组RNA的浓度具有线性关系，通过智能手机颜色识别器App从而能够将新冠病毒基因组RNA的浓度即新型冠状病毒拷贝数转化成具体的数值输出。

较优地，具体步骤如下：

target DNA存在时能够激发Cas12a-crRNA复合物的核酸特异性识别引发的附属切割能力，即切割无关单链DNA；在此情况下，若选择合成一条，将其一端修饰荧光基团，另外一端修饰淬灭基团，制备成reporter DNA，即报告DNA，reporter DNA就能被Cas12a酶切，产生增强的荧光信号进行输出；此荧光信号的变化和待检测新型冠状病毒的浓度能够成线性关系，能够检测和定量新型冠状病毒；而纳米金显色实验中，linker-ssDNA序列的两端设计为可与纳米金颗粒交联的DNA序列即DNA1/2-AuNPs互补配对；后续将Cas12a/crRNA系统与DNA1/2-AuNPs等体积混合，当linker-ssDNA被Cas12a降解时，DNA1/2-AuNPs保持分散状态从而呈现红色；其颜色的深浅可通过智能手机颜色识别器APP灰度分析读取数值；灰度分析得到的数值和待检测新型冠状病毒的浓度能够成线性关系，能够检测和定量新型冠状病毒。

较优地，具体步骤如下：

通过两步法来检测新型冠状病毒的RNA来得到target DNA，当Cas12a-crRNA检测到相应的target DNA时，即target DNA和crRNA能够互补配对，就能够切割荧光探针，使荧光基团FAM脱离猝灭基团BHQ1，造成BHQ1对FAM荧光的猝灭被解除，FAM荧光值增加能够与新型冠状病毒浓度成线性关系，能够特异性地检测和定量特定新型冠状病毒；此外，当linker-ssDNA被Cas12a降解时，DNA1/2-AuNPs保持分散状态从而呈现红色；其颜色的深浅可通过智能手机APP颜色识别器灰度分析读取数值或者通过Tecan

较优地，具体步骤如下：

(1)SARS-CoV-2质粒构建：合成含有新型冠状病毒N基因片段NC_045512.2的双链DNA，并通过BamHIandEcoR I酶切和T4 DNA连接酶链接构建到PLVX-AcGFP-N1慢病毒载体中，以获得SARS-CoV-2质粒，构建的质粒命名为lentiSARS-CoV-2-N的质粒；

合成的SARS-CoV-2基因片段序列信息(5’-3’)为SEQ ID NO.1：

catcgtgttgtctgtactgccgttgccacatagatcatccaaatcctaaaggattttgtgacttaaaaggtaagtatgtacaaatacctacaacttgtgctaatgaccctgtgggttttacacttaaaaacacagtctgtaccgtctgcggtatgtggaaaggttatggctgtagttgtgatcaactccgcgaacccatgcttcagtcagctgatgcacaatcgtttttaaacgggtttgcggtgtaagtgcagcccgtcttacaccgtgcggcacaggcactagtactgatgtcgtaagctggacttccctatggtgctaacaaagacggcatcatatgggttgcaactgagggagccttgaatacaccaaaagatcacattggcacccgcaatcctgctaacaatgctgcaatcgtgctacaacttcctcaaggaacaacattgccaaaaggcttctacgcagaagggagcagaggcggcagtcaagcctcttctcgttcctcatcacgtagtcgcaacagttcaagaaattcaactccaggcagcagtaggggaacttctcctgctagaatggctggcaatggcggtgatgctgctcttgctttgctgctgcttgacagattgaaccagcttgagagcaaaatgtctggtaaaggccaacaacaacaaggccaaactgtcactaagaaatctgctgctgaggcttctaagaagcctcggcaaaaacgtactgccac

(2)SARS-CoV-2假病毒包装：将构建的含有SARS-CoV-2N基因和ORF1ab基因片段的质粒lentiSARS-CoV-2-N与psPAX2(Addgene plasmid#12260)和pMD2.G(Addgene plasmid#12259)质粒共转染到293T细胞中，转染48小时后，收集细胞培养上清，经过0.45μm滤膜过滤，获得含有SARS-CoV-2基因片段的慢病毒，即SARS-CoV-2假病毒；

(3)SARS-CoV-2N片段基因扩增：利用SARS-CoV-2特异的引物扩增N片段，扩增引物序列如下：

F：SEQ ID NO.2：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT

R：SEQ ID NO.3：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG

(4)将新型冠状病毒质粒转录得到RNA，将得到的RNA进行梯度稀释，梯度稀释的RNA逆转录得到cDNA，经过PCR扩增后的产物用于Cas12a/crRNA系统荧光检测；

(5)将新型冠状病毒质粒转录得到RNA，将得到的RNA进行梯度稀释，梯度稀释的RNA逆转录得到cDNA，经过PCR扩增后的产物用于Cas12a/crRNA系统联合纳米金显色检测；

(6)提取含有新型冠状病毒N基因片段的慢病毒RNA，将得到的RNA进行梯度稀释，梯度稀释的RNA逆转录得到cDNA，经过PCR扩增后的产物用于Cas12a/crRNA系统荧光检测；

(7)提取含有新型冠状病毒N基因片段的慢病毒RNA，将得到的RNA进行梯度稀释，梯度稀释的RNA逆转录得到cDNA，经过PCR扩增后的产物用于Cas12a/crRNA系统联合纳米金显色检测。

如上所述的基于CRISPR-Cas12a系统的可视化病毒检测方法在微生物的检测方面中的应用。

如上所述的基于CRISPR-Cas12a系统的可视化病毒检测方法在新型冠状病毒的检测方面中的应用。

具体地，相关制备及检测如下：

具体步骤如下：

1.crRNA的设计与合成

1.1设计SARS-CoV-2N基因序列特异的crRNA序列并进行基因合成。crRNA合成序列见NO1。

1.2首先，将由公司合成后得到的crRNA模板(序列:

5’-TCTGTACCGTCTGCGGTATGTGATCTACACTTAGTAGAAATTACCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC)，使用离心机12000rpm离心10min，然后使用DEPC水将其溶解并稀释至4μM。然后将配置好的溶液于PCR仪中与T7 promoter(序列：

GAAATTAATACGACTCACTATAGGG)聚合成DNA双链，退火完成后，使用HiScribe T7快速高效RNA合成试剂盒进行转录步骤。取出PCR仪中37℃孵育过夜的转录样品，向上一步的反应体系中加入2μL DNase I(2000U/mL)，并用移液器混合均匀，瞬时离心使溶液全部汇集于管底，置于热循环仪上37℃孵育反应30min，以彻底消除体系中的DNA模板，随后按照Monarch RNA纯化试剂盒说明书步骤进行RNA纯化。纯化后的RNA使用Eppendorf

2.CRISPR-LbCas12a检测新型冠状病毒选择性实验

为了验证Cas12a检测新型冠状病毒是否具有所描述的较好的选择性，进行了选择性验证实验，如图3所示，当Cas12a、crRNA以及不同靶标targt DNA时，只有加入新型冠状病毒target DNA才具有较高的荧光值，而当体系中分别加入其他的靶标SARS-CoV；MERS-CoV；MHV；IAV；S.aureus；Top10；Hela等时，其荧光值都比较低，说明Cas12a检测新型冠状病毒选择性良好。

3.CRISPR-LbCas12a检测新型冠状病毒可行性实验

3.1新型冠状病毒N基因片段PCR扩增

根据SARS-CoV-2基因序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成含有新型冠状病毒N基因片段(NC_045512.2)的双链DNA，选择合适的限制性核酸内切酶序列，并设计新型冠状病毒N基因上游引物(GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT)和下游引物(CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG)构建的新型冠状病毒质粒pGH 1abN,将提取的pGH 1abN质粒作为PCR模版进行PCR反应。

为了验证Cas12a是否具有所描述的核酸特异性识别引发的附属切割能力，进行了可行性验证实验，如图1所示，当且仅当Cas12a、crRNA以及与crRNA互补的target DNA同时存在时才会产生强烈的荧光信号，初步证明了本发明方法的可行性，具有特异性识别能力。

3.2CRISPR-LbCas12a检测新型冠状病毒RNA依赖性实验

为了验证Cas12a是否具有所描述的较高的核酸检测灵敏度，进行了灵敏度验证实验，如图2所示，当且仅当Cas12a、crRNA以及不同梯度的RNA进行逆转录后PCR扩增的产物结合时，能检测到1aM，初步证明了本发明方法的较高的灵敏度。并且线性良好。

4.基于CRISPR-LbCas12a检测新型冠状病毒基因组实验

4.1细胞复苏

(1)预先在无菌的生物安全柜中取10mL新鲜培养的DMEM培养基置于15mL离心管中。

(2)取出冻存的293T细胞，放入提前预热的已升到37℃的水浴锅中，快速晃动细胞使其解冻。

(3)吸取1mL新鲜DMEM培养基于冻存管中混合，然后再将细胞混悬液全部快速转移至提前准备的10mL新鲜培养基中，上下颠倒轻轻混匀，于800r/min离心3分钟。

(4)弃除离心后的上层培养基，再用2mL培养基吹散细胞团，转移至干净的细胞培养皿中，放置在培养箱中以37℃条件进行培养。

(5)次日，对细胞的生长情况做出判断，以对细胞进行新鲜培养基更换或传代处理。

4.2细胞传代

(1)细胞生长状态良好，其密度约占培养皿底部的90-100％时即可传代。在无菌的生物安全柜中，将培养皿内的原培养基小心弃除，然后用移液枪缓慢往细胞表面加入2mL的PBS，小心轻晃培养皿以清洗掉细胞表面的废弃代谢物及残留的培养基。

(2)弃除PBS后，加入约1mL含EDTA的胰蛋白酶消化液，使其能足够覆盖细胞，静置约6s。

(3)镜下观察细胞变圆后，立即弃除掉消化液，并加入约1-2mL的新鲜培养基终止消化，并利用移液器缓慢吹吸培养基轻轻吹悬细胞。

(4)将细胞收集转移到15mL离心管中，于800r/min离心4min后，弃去上清液，再加入新鲜DMEM培养基吹散细胞，移取适量细胞混悬液置于新的培养皿中。

(5)将293T细胞培养皿放置入37℃细胞培养箱中培养。

4.3细胞转染及慢病毒包装

4.3.1LentiSARS-CoV-2-N1的慢病毒利用HEK 293T细胞进行制备

(1)将良好生长的HEK293T细胞均匀铺至到4个6cm细胞培养皿中，放置到细胞培养箱中进行培养。

(2)待HEK293T细胞的生长密度达到80％-90％时，利用Turbofect对三质粒体系进行转染，目的质粒：包装质粒：包膜质粒＝4:3:1，将包含目的质粒的转染混合物静置约18-20分钟，然后逐滴加入到HEK293T细胞的表面后，用手轻晃培养皿达到混合物直至均匀分布在6cm细胞培养皿中，放回培养箱中培养12小时。

(3)取出培养12小时后的细胞，于无菌的生物安全柜中小心的轻轻更换成新鲜培养基，防止吹掉半贴壁的HEK293T细胞，并再次过夜培养。

(4)从更换新鲜培养基培养后的第48个小时左右，观察6cm细胞培养皿中的细胞状态，如果细胞存活率在30％左右时，即移液器轻轻吸取细胞培养皿内包含病毒的培养基，转移至提前裹有干净锡箔纸的15mL离心管中，收集的上清于4度离心机(提前预冷离心机)，3000rpm,10min，将收集的上清液于0.45μM的滤膜过滤，然后每管500μM避光保存在-80度冰箱。

(5)病毒侵染实验

a)利用细胞进行HEK293T细胞慢病毒的侵染

b)将生长状态良好的HEK293T细胞均匀铺至3cm细胞培养皿中，放置到37℃的细胞培养箱中进行培养。

c)待HEK293T细胞的生长密度达到约30-40％时，进行慢病毒侵染，即在无菌的离心管中提前加入1.5mL新鲜培养基，并以8μg/mL的终浓度混合聚凝胺(polybrene)，混合均匀后缓慢加入至HEK293T细胞中。48h后，在倒置荧光显微镜下观察细胞中GFP荧光蛋白的表达量。

4.3.2新型冠状病毒基因组RNA的提取

(1)使用TIANamp Virus RNAKit试剂盒提取新型冠状病毒基因组。简单的说，取280μL收集的病毒液，加入2μL的Carrier RNA和1.12mL的Buffer PL，涡旋振荡15s,混匀，简短离心以收集附着在管壁及管盖上面的液体。室温(15℃-20℃)孵育10min。再向其中加入1.12mL无水乙醇。充分混匀。后面步骤按照说明书要求进行柱式RNA的提取。

(2)新型冠状病毒基因组cDNA的制备和PCR对cDNA进行扩增

将提取好的新型冠状病毒基因组RNA进行10倍梯度稀释，稀释好的样品作为模版加入到体系中，对新型冠状病毒基因按照说明书进行逆转录得到cDNA并通过PCR仪进行扩增。

4.4基于CRISPR-LbCas12a检测新型冠状病毒基因组荧光强度实验

每个100μL反应体系均包括15nM购买的LbCas12a，12.5nM crRNA，200nM淬灭reporter DNA，和5μL不同浓度的体外PCR扩增产物，反应buffer成分为10×NEB2.1buffer，在37℃下使用

4.5qPCR探针法检测新型冠状病毒

根据中国CDC标准，设计新型冠状病毒N基因的上游引物(GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT)和下游引物(CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG)和探针(5’-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3’)检测新型冠状病毒，其结果如图4C和4D所示。

5.基于CRISPR-LbCas12a检测新型冠状病毒基因组结合纳米金显色实验

5.1纳米金的制备以及纳米金与DNA的连接

(1)纳米金的制备过程

纳米金的制备过程中所有用到的玻璃器皿都需要在王水(HNO

5.2DNA和纳米金的连接

使用基于冷冻的标记方法制备了两种类型的DNA功能化的纳米金。取巯基DNA 1(100μM,3μL)(序列:5’-C6-SH-AAAAAAAAACCCAGGTTCTCT-3’))或巯基DNA 2(序列：5’-TCACAGATGCGTAAAAAAAAA-C6-SH-3’))和纳米金(13nm，100μL)混合在一起放入实验室冷冻室内(温度设定为-20℃)2h，然后在室温下解冻。解冻后，在4℃下以12,000rpm/min的速度离心30min，弃去上清，用缓冲溶液A(5mM HEPES缓冲液，pH 7.6)吹悬起来，并重复此操作三次。最后，将沉淀重悬于缓冲液B(10mM HEPES，pH 7.6，300mMNaCl)中，并将所得的DNA-AuNPs探针避光保存在4℃

5.3纳米金显色实验检测新型冠状病毒

将含有15nM LbCas12a，12.5nM crRNA，46nM Linker DNA(序列：ACGCATCTGTGAAGAGAACCTGGG)和不同浓度目标DNA的反应混合物在HEPES缓冲液中于37℃孵育25min，接着65℃失活8min。然后取50μL此反应混合物与25μL DNA1-AuNPs和25μL DNA2-AuNPs溶液混合，并在37℃下孵育10min。离心(5000rpm，3min)后吸取上清液，弃沉淀。然后手机拍照记录上清液的颜色和测定其吸光度值(A526)。其结果如图5A，5B和5C所示。其颜色深浅通过智能手机APP灰度分析如图5D，5E，5F所示。

6.食品加标实验

首先使用称量100mg猪肉，再加入不同梯度的新冠病毒液300μL。然后，将这些已确认的新冠病毒液阴性猪肉样品掺入不同拷贝数的新冠病毒液(使用qPCR计算新型冠状病毒的拷贝数)。将样品通过组织研磨机研磨，将8000rpm离心5分钟于4℃，后取上清280μL，加入2μL的Carrier RNA和1.12mL的Buffer PL，涡旋振荡15s,混匀，简短离心以收集附着在管壁及管盖上面的液体。室温(15℃-20℃)孵育10min。再向其中加入1.12mL无水乙醇。充分混匀。后面步骤按照说明书要求进行柱式RNA的提取。提取的RNA样品按照之前的步骤逆转录得到cDNA,将得到的cDNA一部分用于qPCR检测，如图6A和6B；一部分通过RCR扩增用于Cas12a荧光检测，如图6C和6D所示；另一部分用于纳米金显色实验。其结果如图6E和6F中所示；智能手机App灰度分析柱状图如图6G所示。

7.Cas12a检测新型冠状病毒与其他方法比较图

7A和7B：qPCR,Cas12a检测新型冠状病毒和纳米金显色检测新型冠状病毒基因组三种方法比较热图分析。7C：ROC曲线分析，7D：韦恩图分析。

8.纳米金显色实验检测临床样本实验。

8.1临床50个样品cDNA的制备和PCR对cDNA进行扩增将提取好的新型冠状病毒基因组RNA(由天津市疾控中心提供)作为模板，加入0.66μM引物(CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG)于15μL体系，75℃，5min后，迅速放在冰上，冰浴5min。再向其中加入5μL M-MLV 5×buffer，0.5mM dNTP MiX，8Units M-MLV，1Units RNasin inhibitor于25μL体系在42℃中，逆转录1h。得到的cDNA用于下一步PCR扩增。

8.2临床50个样品cDNAPCR扩增。

将上述逆转录的到的cDNA各取5uL作为模板，分别向其中加入0.25μM的上游引物(GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT)，0.25μM的下游引物(CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG)和10uL 2×Taq PCR MasterMixⅡ于PCR仪中进行扩增，得到dsDNA(靶标DNA)。

8.3可视化检测新型冠状病毒。

8.3.1纳米金的制备过程

纳米金的制备过程中所有用到的玻璃器皿都需要在王水(HNO

8.3.2DNA和纳米金的连接

使用基于冷冻的标记方法制备了两种类型的DNA功能化的纳米金。取巯基DNA 1(100μM,3μL)(序列:5’-C6-SH-AAAAAAAAACCCAGGTTCTCT-3’))或巯基DNA 2(序列：5’-TCACAGATGCGTAAAAAAAAA-C6-SH-3’))和纳米金(13nm，100μL)混合在一起放入实验室冷冻室内(温度设定为-20℃)2h，然后在室温下解冻。解冻后，在4℃下以12,000rpm/min的速度离心30min，弃去上清，用缓冲溶液A(5mM HEPES缓冲液，pH 7.6)吹悬起来，并重复此操作三次。最后，将沉淀重悬于缓冲液B(10mM HEPES，pH 7.6，300mM NaCl)中，并将所得的DNA-AuNPs探针避光保存在4℃

8.3.3纳米金显色实验检测临床样本

向上述扩增后的不同的靶标DNA分别加入15nM LbCas12a，12.5nM crRNA，46nMLinker DNA(序列：ACGCATCTGTGAAGAGAACCTGGG)在HEPES缓冲液中于37℃孵育25min，接着65℃失活8min。然后取50μL此反应混合物与25μL DNA1-AuNPs和25μL DNA2-AuNPs溶液混合，并在37℃下孵育10min。离心(5000rpm，3min)后使样品沉淀。吸取上清液，然后手机拍照记录上清液的颜色和测定其吸光度值(A526)。其结果如图8A，8B和8C所示。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种基于CRISPR-Cas12a系统的可视化病毒检测方法及应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 739

<212> DNA/RNA

<213> 合成的SARS-CoV-2 基因片段序列信息(Unknown)

<400> 1

catcgtgttg tctgtactgc cgttgccaca tagatcatcc aaatcctaaa ggattttgtg 60

acttaaaagg taagtatgta caaataccta caacttgtgc taatgaccct gtgggtttta 120

cacttaaaaa cacagtctgt accgtctgcg gtatgtggaa aggttatggc tgtagttgtg 180

atcaactccg cgaacccatg cttcagtcag ctgatgcaca atcgttttta aacgggtttg 240

cggtgtaagt gcagcccgtc ttacaccgtg cggcacaggc actagtactg atgtcgtaag 300

ctggacttcc ctatggtgct aacaaagacg gcatcatatg ggttgcaact gagggagcct 360

tgaatacacc aaaagatcac attggcaccc gcaatcctgc taacaatgct gcaatcgtgc 420

tacaacttcc tcaaggaaca acattgccaa aaggcttcta cgcagaaggg agcagaggcg 480

gcagtcaagc ctcttctcgt tcctcatcac gtagtcgcaa cagttcaaga aattcaactc 540

caggcagcag taggggaact tctcctgcta gaatggctgg caatggcggt gatgctgctc 600

ttgctttgct gctgcttgac agattgaacc agcttgagag caaaatgtct ggtaaaggcc 660

aacaacaaca aggccaaact gtcactaaga aatctgctgc tgaggcttct aagaagcctc 720

ggcaaaaacg tactgccac 739

<210> 2

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 扩增N片段引物F(Unknown)

<400> 2

ggggaacttc tcctgctaga at 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 扩增N片段引物R(Unknown)

<400> 3

cagacatttt gctctcaagc tg 22

<210> 4

<211> 68

<212> DNA/RNA

<213> crRNA模板(Unknown)

<400> 4

tctgtaccgt ctgcggtatg tgatctacac ttagtagaaa ttaccctata gtgagtcgta 60

ttaatttc 68

<210> 5

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 探针(Unknown)

<400> 5

ttgctgctgc ttgacagatt 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 巯基DNA 1 (Unknown)

<400> 6

aaaaaaaaac ccaggttctc t 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 巯基DNA 2(Unknown)

<400> 7

tcacagatgc gtaaaaaaaa a 21

<210> 8

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> Linker DNA(Unknown)

<400> 8

acgcatctgt gaagagaacc tggg 24