一种双酶偶联全细胞催化马来酸合成L-丙氨酸的方法

摘要

本发明公开了一种双酶偶联全细胞催化马来酸合成L‑丙氨酸的方法，属于生物工程领域。本发明通过统建一种偶联表达马来酸顺反异构酶和L‑天冬氨酸β脱羧酶的重组菌株，并对该重组菌株进行宿主菌改造优化，获得能够全细胞高转化率催化马来酸生成L‑丙氨酸的重组菌。该重组菌株能够利用价格相对便宜的马来酸生成L‑丙氨酸，几乎没有中间产物富马酸和L‑天冬氨酸的积累，转化率到达96％以上，最高生产速率达28.43g/(L·h)，最高产量达261.2g/L。

说明书

技术领域

本发明涉及一种双酶偶联全细胞催化马来酸合成L-丙氨酸的方法，属于生物工程领域。

背景技术

L-丙氨酸(L-Alanine,L-Ala)是最小的手性分子之一。其在食品、医药、化工等领域都有着广泛的应用和较大的市场开发潜力。主要用于生化研究、组织培养、肝功能测定、增味剂、可增加调味品的调味效果、还可用作酸味矫正剂，改善有机酸的酸味。

目前工业上制备L-丙氨酸的方法主要是化学合成法和生物法。在化学合成生产中，丙酸氯化法是合成L-丙氨酸的常见思路，但该方法存在产品质量差，合成路线长，收率低，成本高，环境污染严重等缺点，不适合工业生产。

而生物法制备L-丙氨酸成为工业上常用的手段；生物法主要包括催化法和发酵法，发酵法主要以葡萄糖为原料厌氧发酵生产，再分离纯化得到产品L-丙氨酸。此工艺原料廉价易得，流程简单，但是提取困难且没有酶法催化立体选择性强等。相比较而言，全细胞催化转化法具有立体选择性强，转化率高、反应条件温和及环境污染小等优点，且一锅法多酶级联催化不需要酶的分离纯化和中间产物的分离提纯，还便于细胞的回收重复利用，极大的降低成本，因此一锅法全细胞催化转化法具有更好的应用前景。

但是，现有技术当中，全细胞转化合成L-丙氨酸存在成本高，工艺复杂的技术问题，例如，公开号为CN109456928A的中国发明专利申请文本中记载，通过构建重组大肠杆菌，获得具有高酶活的L-天冬氨酸β-脱羧酶菌株，将重组菌株摇瓶发酵，以L-Asp-Na作为底物，进行全细胞催化反应制备L-丙氨酸。虽然此法终产物L-丙氨酸产率达到94％以上，但是其采用的是天冬氨酸为底物，而天冬氨酸价格比较昂贵，不利于大规模的工业化生产。而发酵法虽然成本低，但是工艺操作复杂耗时较长，例如，公开号为CN109355242A的中国发明专利申请文本中记载，采用葡萄糖发酵法制备L-丙氨酸，产量在发酵55h后达到171.0g/L,发酵过程中需要经过两种阶段的发酵，发酵工艺相较复杂。

因此，寻找一种低成本底物，并且一种能够采用该低成本底物反应制备L-丙氨酸的基因工程菌，成为研究的热点和难点。

发明内容

技术问题：

本发明要解决的技术问题是：提供一种反应制备L-丙氨酸的低成本的底物，同时，提供一种能够采用该低成本底物反应制备L-丙氨酸的基因工程菌，及全细胞转化制备L-丙氨酸的方法。

技术方案：

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种偶联表达马来酸顺反异构酶(粘质沙雷氏菌来源)和L-天冬氨酸β脱羧酶(假单胞菌P.dacunhae 21192来源)的基因工程菌，并对该重组菌株进行宿主菌改造优化，获得能够全细胞高转化率催化马来酸生成L-丙氨酸的基因工程菌(反应原理如图1所示)。

本发明提供了一种基因工程菌，所述基因工程菌以敲除了基因组中△fumAC基因的E.coli BL21(DE3)为表达宿主(E.coli BL21(DE3)△fumAC)，偶联表达了马来酸顺反异构酶和L-天冬氨酸β脱羧酶。

在本发明的一种实施方式中，所述表达宿主E.coli BL21(DE3)△fumAC的构建方法公开于文章：房月芹，周丽，周哲敏.重组大肠杆菌全细胞转化马来酸高效合成富马酸[J].食品与生物技术学报,2016,35(12):1323-1329。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以pRSF

在本发明的一种实施方式中，所述马来酸顺反异构酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述L-天冬氨酸β脱羧酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述马来酸顺反异构酶的基因的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述L-天冬氨酸β脱羧酶的基因的核酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，还采用T

在本发明的一种实施方式中，所述T

在本发明的一种实施方式中，所述马来酸顺反异构酶和L-天冬氨酸β脱羧酶在载体上的位置关系为：表达载体-L-天冬氨酸β脱羧酶-马来酸顺反异构酶。

本发明还提供了一种制备L-丙氨酸的方法，所述方法为，以上述基因工程菌，或该基因工程菌产生的酶为催化剂，以马来酸为底物，制备得到L-丙氨酸。

在本发明的一种实施方式中，底物马来酸的终浓度为2～3mol/L。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以细胞菌悬液的形式添加至底物当中，所述细胞菌悬液与底物溶液的体积比为2：8。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌菌体浓度OD

本发明还提供了上述基因工程菌，或上述方法在制备含有L-丙氨酸产品中的应用。

有益效果

(1)本发明提供了一株能高效表达马来酸顺反异构酶和L-天冬氨酸β脱羧酶的基因工程菌，该重组菌株能够利用价格相对便宜的马来酸生成L-丙氨酸，其生产方法工艺简单，成本较低，有利于后续大规模工业生产。

(2)采用本发明构建的基因工程菌全细胞转化马来酸制备得到L-丙氨酸产量高，生产效率高，而且几乎没有中间产物富马酸和L-天冬氨酸的积累；以2M马来酸为底物时，6h反应完全，产量达到170.6g/L，生产速率达到28.43g/(L·h)；以2.5M马来酸为底物时，10h反应完全，产量达到220.02g/L，生产速率达到22.02g/(L·h)；以3M马来酸为底物时，15h反应完全,产量达到261.2g/L，生产速率达到17.41g/(L·h)，转化率均达到96％以上。

附图说明

图1：马来酸合成L-丙氨酸的三酶级联反应示意图。

图2：MaiA与ASD偶联表达的不同策略。

图3：重组质粒的酶切验证结果；其中，M：marker；1：pAM重组质粒的NotⅠ单酶切验证；2：pAM重组质粒的NdeⅠ、XhoⅠ双酶切验证；3：pAM重组质粒的NotⅠ、EcoRⅠ双酶切验证；4：pMA重组质粒的HindⅢ单酶切验证；5：pMA重组质粒的BamHⅠ、HindⅢ双酶切验证；6：pMA重组质粒的NdeⅠ、XhoⅠ双酶切验证。

图4：不同偶联表达的SDS-PAGE结果；其中，M：marker；1：pAM未诱导；2：pAM上清表达结果；3：pAM沉淀表达结果；4：pMA未诱导；5：pMA上清表达结果；6：pMA沉淀表达结果。

图5：不同串联方式表达的两种菌株在pH 6～8条件下催化马来酸的能力比较。

图6：不同的细胞催化2M马来酸结果；其中，图6a：E.coli BL21(DE3)/pRSF

图7：E.coli BL21(DE3)ΔfumAC-T7-RBS/AspA/pRSF

图8：E.coli BL21(DE3)ΔfumAC-T7-RBS/AspA/pRSF

图9：不同来源ASD酶在pH 5.0条件下全细胞催化富马酸生成丙氨酸的能力比较。

具体实施方式

下述实施例中所涉及的马来酸购自阿拉丁。

下述实施例中所涉及的培养基如下：

LB液体培养基：10g/L蛋白胨、5g/L酵母膏、l0 g/L NaCl。

LB固体培养基：是在LB液体培养基上添加0.2g/L琼脂。

2YT液体培养基：16g/L蛋白胨、10g/L酵母膏、5g/L NaCl。

下述实施例中所涉及的检测方法如下：

马来酸、富马酸、L-天冬氨酸和L-丙氨酸的检测方法：马来酸、富马酸、L-天冬氨酸和L-丙氨酸的浓度都用高效液相色谱(HPLC)法检测。

马来酸、富马酸的HPLC检测条件：色谱柱Spursil 5μm C18(250×4.6mm,5μm)，流动相为pH 2.5、浓度25mM的K

实施例1：L-天冬氨酸β脱羧酶的选择

调整L-天冬氨酸β脱羧酶为其他3种来源的L-天冬氨酸β脱羧酶，分别为：GenBank:AP019740.1的ArASD(以下简称ASD-1)、核酸序列如SEQ ID NO.4所示的编码L-天冬氨酸β脱羧酶Pd21192ASD(以下简称ASD-2)、GenBank:WP_016451742.1的pET28a-Pd19121ASD(以下简称ASD-3)；

由金维智公司基因合成重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-ASD-1、E.coli BL21(DE3)/pET28a-ASD-2、E.coli BL21(DE3)/pET28a-ASD-3保存于保藏管中，制备得到的单菌落接种于5mL的抗生素浓度为50mg/mL的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养8h，制备得到种子液；然后分别以2％(v/v)的接种量将种子液转接到装有50mL的2YT培养基的250mL的摇瓶中，抗生素卡那浓度为50mg/mL，37℃、200rpm培养到OD

收集制备得到的诱导表达的细胞，用pH 5.0的50mM的磷酸盐缓冲液重悬细胞，稀释到OD

结果图9所示，结果表示Pd21192ASD在pH 5.0富马酸的催化下，4h后丙氨酸的生成量最多，比其他两种ASD的催化效果更好。

因此，选择核酸序列如SEQ ID NO.4所示的编码L-天冬氨酸β脱羧酶Pd21192ASD作后续研究。

实施例2：构建偶联表达马来酸顺反异构酶和L-天冬氨酸β脱羧酶的重组载体

具体步骤如下：

(1)根据核酸序列如SEQ ID NO.2所示的编码马来酸顺反异构酶的基因和核酸序列如SEQ ID NO.4所示的编码L-天冬氨酸β脱羧酶的基因和载体，选择酶切位点，设计引物，如表1所示：

表1：酶切连接引物设计

注:下划线标出的为酶切位点

(2)化学合成核酸序列如SEQ ID NO.2所示的编码马来酸顺反异构酶的基因MaiA和核酸序列如SEQ ID NO.4所示的编码L-天冬氨酸β脱羧酶的基因ASD，采用NdeⅠ、XhoⅠ、EcoRⅠ、NotⅠ、BamHⅠ、HindⅢ酶对上述基因的酶和质粒载体pRSF

(3)用核酸定量仪测定回收后的基因和载体片段的浓度，按基因片段:载体片段＝3:1的比例混合，再加T4DNA连接酶在16℃过夜连接；将连接产物转化到JM109的感受态细胞里，然后涂布到载体相应的卡那抗生素抗性的LB固体培养基上；

(4)先菌落PCR验证，然后挑取单菌落到5mL的抗生素浓度为50mg/mL的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养8h，提质粒进行双酶切验证(如图3)，将验证正确的菌进行测序，测序正确即得到重组质粒pRSF

实施例3：构建偶联表达马来酸顺反异构酶和L-天冬氨酸β脱羧酶的重组菌株及酶的表达

具体步骤如下：

(1)将实施例1制备得到的重组质粒pRSF

(2)挑取步骤(1)制备得到的单菌落接种于5mL的抗生素浓度为50mg/mL的LB培养基中，37℃、200rpm培养8小时,然后分别以2％(v/v)的接种量转接到装有50mL的2YT培养基的250mL的摇瓶中，抗生素卡那浓度为50mg/mL，37℃、200rpm培养到OD

(3)各取相同量的诱导表达细胞，重悬细胞，超声破碎得到粗酶液SDS-PAGE电泳分析目的蛋白的表达情况(如图4)，当MaiA和ASD串联表达时，不同的串联方式，两个酶的表达水平相差也较大。

结果显示：pRSF

实施例4：重组菌株全细胞转化马来酸生成L-丙氨酸

具体步骤如下：

收集实施例2制备得到的重组细胞E.coli BL21(DE3)△fumAC/pRSF

结果显示，E.coli BL21(DE3)△fumAC/pRSF

实施例5：重组菌株全细胞转化马来酸生成L-丙氨酸

(1)构建E.coli BL21(DE3)ΔfumAC-T7-RBS/AspA

将核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的T

(2)将重组质粒pRSF

(3)首先配置pH 7.5的马来酸溶液，此过程用氨水调节马来酸的pH到7.5。收集步骤(2)中诱导表达的细胞，用pH 7.5的50mM的磷酸盐缓冲液重悬细胞，稀释到OD

表2：不同菌株反应6h后反应液中马来酸、富马酸、L-天冬氨酸和L-丙氨酸的含量

如图6a～图6c和表2所示，未经过改造的E.coli BL21(DE3)/pRSF

实施例6：重组菌株全细胞转化马来酸生成L-丙氨酸

收集实施例4制备得到的诱导表达的细胞E.coli BL21(DE3)ΔfumAC-T7-RBS/AspA/pRSF

结果如图7所示，表示E.coli BL21(DE3)ΔfumAC-T7-RBS/AspA/pRSF

实施例7：重组菌株全细胞转化马来酸生成L-丙氨酸

收集实施例4制备得到的诱导表达的细胞E.coli BL21(DE3)ΔfumAC-T7-RBS/AspA/pRSF

结果如图8所示，E.coli BL21(DE3)ΔfumAC-T7-RBS/AspA/pRSF

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种双酶偶联全细胞催化马来酸合成L-丙氨酸的方法

<130> BAA210407A

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 250

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ser Asn His Tyr Arg Ile Gly Gln Ile Val Pro Ser Ser Asn Thr

1 5 10 15

Thr Met Glu Thr Glu Ile Pro Ala Met Leu Ala Ala Arg Gln Leu Ile

20 25 30

Arg Pro Glu Arg Phe Thr Phe His Ser Ser Arg Met Arg Met Lys His

35 40 45

Val Asn Lys Glu Glu Leu Ala Ala Met Asp Ala Glu Ser Asp Arg Cys

50 55 60

Ala Leu Glu Leu Ser Asp Ala Arg Val Asp Val Leu Gly Tyr Ala Cys

65 70 75 80

Leu Val Ala Ile Met Ala Met Gly Leu Gly Tyr His Arg Glu Ser Gln

85 90 95

Ala Arg Leu Ala Gln Val Thr Lys Asp Asn Gln Ala Ala Ala Pro Val

100 105 110

Ile Ser Ser Ala Gly Ala Leu Val Asn Gly Leu Lys Val Ile Gly Ala

115 120 125

Lys Arg Ile Ala Leu Val Ala Pro Tyr Met Lys Pro Leu Thr Gln Leu

130 135 140

Val Val Asp Tyr Ile Gln His Glu Gly Ile Glu Val Lys Val Trp Arg

145 150 155 160

Ala Leu Glu Ile Pro Asp Asn Leu Asp Val Ala Arg His Asp Pro Ala

165 170 175

Arg Leu Pro Gly Ile Val Ala Glu Met Asp Leu Arg Glu Val Asp Ala

180 185 190

Ile Val Leu Ser Ala Cys Val Gln Met Pro Ser Leu Pro Ala Val Pro

195 200 205

Thr Val Glu Ala Gln Thr Gly Lys Pro Val Ile Thr Ala Ala Ile Ala

210 215 220

Thr Thr Tyr Ala Met Leu Thr Ala Leu Glu Leu Glu Pro Ile Val Pro

225 230 235 240

Gly Ala Gly Ala Leu Leu Ser Gly Ala Tyr

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<210> 2

<211> 753

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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tccagccgca tgcgcatgaa acacgtcaat aaagaagaat tggcggcgat ggacgccgag 180

tccgatcgct gcgcgctgga gctgtccgac gcgcgggtcg acgtgctcgg ctacgcctgc 240

ctggtggcca tcatggcgat ggggctgggc taccaccgcg aatcgcaggc ccggctggcg 300

caggtgacga aagacaatca ggccgccgcg ccggtcatca gcagcgccgg cgcgctggtc 360

aacggcctga aggtgatcgg cgccaaacgc atcgcgctgg tggcgcccta catgaaaccg 420

ctgacccagc tggtggtgga ctacatccag cacgaaggca tcgaggtcaa ggtatggcgc 480

gcgctggaga tcccggacaa cctcgacgtc gcgcggcacg atccggccag gctgccgggg 540

atcgtcgccg agatggactt acgcgaggtc gatgctatcg tgctgtccgc ctgcgtgcag 600

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<213> 人工序列

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Leu Asn Ala Gly Arg Gly Asn Pro Asn Phe Leu Ala Thr Thr Pro Arg

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130 135 140

Glu Lys Ile Val Arg Gln Tyr Ile Ile Arg Glu Met Gly Ala Asp Ala

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165 170 175

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Ala Gly Asp Lys Val Ala Ile Gly Met Pro Val Phe Thr Pro Tyr Ile

195 200 205

Glu Ile Pro Glu Leu Ala Gln Tyr Ala Leu Glu Glu Val Ala Ile Asn

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Ala Asp Pro Ala Leu Asn Trp Gln Tyr Pro Asp Ser Glu Leu Asp Lys

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Leu Lys Asp Pro Ala Ile Lys Ile Phe Phe Cys Val Asn Pro Ser Asn

245 250 255

Pro Pro Ser Val Lys Met Asp Glu Arg Ser Leu Glu Arg Val Arg Lys

260 265 270

Ile Val Ala Glu His Arg Pro Asp Leu Met Ile Leu Thr Asp Asp Val

275 280 285

Tyr Gly Thr Phe Ala Asp Gly Phe Gln Ser Leu Phe Ala Ile Cys Pro

290 295 300

Ala Asn Thr Leu Leu Val Tyr Ser Phe Ser Lys Tyr Phe Gly Ala Thr

305 310 315 320

Gly Trp Arg Leu Gly Val Val Ala Ala His Lys Glu Asn Ile Phe Asp

325 330 335

Leu Ala Leu Gly Arg Leu Pro Glu Ser Glu Lys Thr Ala Leu Asp Asp

340 345 350

Arg Tyr Arg Ser Leu Leu Pro Asp Val Arg Ser Leu Lys Phe Leu Asp

355 360 365

Arg Leu Val Ala Asp Ser Arg Ala Val Ala Leu Asn His Thr Ala Gly

370 375 380

Leu Ser Thr Pro Gln Gln Val Gln Met Thr Leu Phe Ser Leu Phe Ala

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450 455 460

Gln Ser Ser Thr Gly Asp Met Leu Phe Arg Ile Ala Asp Glu Thr Gly

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Ile Val Leu Leu Pro Gly Arg Gly Phe Gly Ser Asp Arg Pro Ser Gly

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Arg Ala Ser Leu Ala Asn Leu Asn Glu Tyr Glu Tyr Ala Ala Ile Gly

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Arg Ala Leu Arg Gln Met Ala Asp Glu Leu Tyr Ala Gln Tyr Thr Gln

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<210> 4

<211> 1602

<212> DNA

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<400> 4

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gagtcggaac tttcgtattc atatatgaac acggtgggcg tgggaggcct ggcaaagatc 240

gagggcatag aagggcgctt cgagcgctat attgccgaga accgcgatca ggaaggcgtg 300

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ctgaacatca gcgaaaaaat cgtgcgccag tacatcatcc gtgaaatggg ggccgatgca 480

attcccagcg agtccgtgaa cctgtttgcg gtcgaggggg gaacggccgc catggcatac 540

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<212> DNA

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aatcccaaag cggtgatcta tttcacaaat taataattaa ggggtaaaaa ccgacactta 180

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tgcaggggat aatcgtcggt cgaaaaacat tcgaaaccac atatattctg tgtgtttaaa 300

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