用于治疗进行性家族性肝内胆汁淤积症2型(PFIC2)的密码子优化的ABCB11转基因

摘要

本公开涉及用于治疗进行性家族性肝内胆汁淤积症2型的基因治疗载体。更具体地，本发明涉及一种腺相关病毒载体，其包含编码用于治疗PFIC2的BSEP的密码子优化序列。

说明书

技术领域

本公开涉及用于治疗进行性家族性肝内胆汁淤积2型的基因治疗载体。更具体地，本发明涉及腺相关病毒载体，其包含编码用于治疗PFIC2的BSEP的密码子优化序列。

背景技术

进行性家族性肝内胆汁淤积症2型(PFIC2)是一种与ABCB11基因突变相关的遗传疾病，该基因表达胆盐输出泵(BSEP)，一种1,321个氨基酸的蛋白质，分子量约为160kDa(Kubitz,R.et al.2012；Clin Res Hepatol Gas 36(6):536-553)。BSEP主要在肝细胞的小管膜中表达，并参与胆盐从这些细胞向胆汁的转运(Jacquemin,E.2012.Clin Res HepatolGas 36Suppl 1:S26-S35)。PFIC2的体征和症状典型地仅与肝脏疾病有关。PFIC2患者常在生命的最初几年内会发展为肝衰竭。另外，受影响的个体患肝细胞癌的风险增加。PFIC2引起胆汁酸在肝脏中积聚，导致胆汁酸排泄减少，从而在肝细胞中积聚(肝内胆汁淤积)。细胞胆汁积聚导致肝细胞死亡、血液中胆汁释放、严重瘙痒，发展为门脉高压、肝衰竭和肝硬化，最终导致未经治疗的患者死亡。PFIC2是一种罕见疾病，尽管确切发病率尚不清楚，但估计每100,000例新生儿中有1例发生(Gonzales,E.et al.2014.Eur J Hum Genet 22(4))。该病对男女的影响相同，世界各地都有报道。

目前尚无治愈PFIC2的方法，因此未满足的医疗需求非常高。尽管熊去氧胆酸(UDCA)疗法可能会改善某些患者的症状，但除肝移植以外，目前尚无治愈PFIC2的方法(vander Woerd,W.L et al.World J Gastroentero.2017；23(5):763-775)。胆道改道形式的手术干预改善患者的预后。但是，诸如感染和造口袋问题的术后并发症影响患者的生活质量，而肝硬化和肝癌的风险仍然存在。肝移植是一种有效的治疗，但伴随着该复杂过程带来的风险以及病情复发的可能。尽管有当前可用的治疗，PFIC2患者的生活质量和预期寿命仍然受到限制。

纠正导致疾病发展的缺陷基因的基因疗法是用于多种疾病的有前景的治疗方法。但是，该技术仍在研究中。使用包括ABCB11在内的多种潜在治疗基因来治疗肝脏疾病(诸如进行性家族性肝内胆汁淤积症2型(PFIC2))的RNA疗法仅在WO2017/100551或WO2017/001570中提出。因此，仍然需要开发允许稳定且长期的转基因表达的基因治疗方法。

本文中，描述了一种基于通过使用腺相关病毒(AAV)作为载体，将密码子优化版本的ABCB11基因递送至肝脏的新型PFIC2疗法。

令人惊讶地，发明人发现与野生型人BSEP编码基因(BSEP)相反，当在体内施用时，BSEP编码基因的密码子优化序列在肝细胞的小管膜中特异性地显示了有效表达。在重现患者中观察到的大多数PFIC2症状的Abcb11

因此，本公开的第一方面涉及核酸构建体，其包含编码BSEP的转基因，所述转基因是序列SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性的序列。

在特定实施方案中，所述核酸构建体进一步包含在引入宿主细胞后启动转基因表达的启动子，优选肝特异性启动子，更优选α-1-抗胰蛋白酶启动子或胆盐诱导型启动子。

在特定实施方案中，所述核酸构建体进一步包含5’ITR(反向末端重复)和3’ITR序列，优选腺相关病毒(AAV)的5’ITR和3’ITR序列，特别是来自AAV2血清型的5’ITR和3’ITR序列。

在更特定的实施方案中，所述核酸构建体包含核酸序列SEQ ID NO:3或与SEQ IDNO:3具有至少80％同一性的核酸序列或由其组成。

在另一方面，所述核酸构建体包含在表达载体中，优选病毒载体，更优选AAV载体。

本公开的另一方面涉及病毒颗粒，其包含本发明的核酸构建体或表达载体，且优选包含腺相关病毒的衣壳蛋白，诸如选自下组的衣壳蛋白：AAV3 3a型、AAV3 3B型、NP40、NP59、NP84、LK03、AAV3-ST、Anc80和AAV8血清型。

本公开的另一方面涉及包含本发明的核酸构建体或表达载体的宿主细胞，或用本发明的病毒颗粒转导的宿主细胞。

本公开的另一方面涉及药物组合物，其包含本发明的核酸构建体、表达载体、宿主细胞或病毒颗粒，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。

本发明还涉及本发明的产品，其用作药物，诸如在有需要的受试者中预防和/或治疗进行性家族性肝内胆汁淤积症2型。在特定实施方案中，受试者是新生儿、婴儿、儿童或成人，优选新生儿、婴儿或儿童，更优选新生儿或婴儿。

本文还公开了用于制备如上所述的病毒颗粒的方法，其包括以下步骤：a)在培养基中培养如上所述的宿主细胞，和b)从细胞培养上清液和/或细胞内收获病毒颗粒。

本公开还涉及试剂盒，其在一个或多个容器中包含如上所述的核酸构建体、表达载体、宿主细胞、病毒颗粒或药物组合物，任选地还包含说明书或包装材料。

图1.实验中使用的AAVAnc80-wt-hBSEP和AAVAnc80-co-hBSEP载体图。A1AT Pr.：A1AT启动子；ITR：反向末端重复；pA：合成的聚腺苷酸化序列

图2.用表达hBSEP的AAV质粒转染的细胞的免疫荧光。将Huh-7和HepG2细胞分别用pAAV-co-hBSEP和pAAV-wt-hBSEP载体转染，并在72小时后用特异性抗hBSEP抗体进行免疫荧光分析。细胞核用DAPI染色。放大倍率：400X。

图3.Abcb11

图4.hBSEP的体内表达。四周龄的雌性Abcb11

图5.Abcb11

图6.AAVAnc80-co-hBSEP处理后，Abcb11

图7.在AAVAnc80-co-hBSEP处理后一个月，Abcb11

图8.用表达BSEP的AAV载体处理的Abcb11

图9.用表达BSEP的AAV载体处理的Abcb11

图10.用表达BSEP的AAV载体处理的Abcb11

本发明涉及包含编码胆盐输出泵(BSEP)的密码子优化序列(NCBI参考序列：NP_003733.2)的转基因。ABCB11基因(又称BSEP基因)编码的膜相关蛋白是ATP结合盒(ABC)转运蛋白超家族成员。该基因编码在胆盐的肠肝循环中起重要作用的肝脏转运蛋白。该基因突变导致某种形式的进行性家族性肝内胆汁淤积症，这是一类从婴儿早期就有严重的胆汁淤积性肝病的遗传性疾病。

如本文所用，术语“转基因”是指编码基因产物的外源DNA或cDNA。基因产物可以是RNA、肽或蛋白质。除了基因产物的编码区之外，转基因可包括一个或多个元件或与之相关以促进或增强表达，诸如启动子、增强子、响应元件、报告元件、隔绝元件、聚腺苷酸化信号和/或其它功能元件。本发明的实施方案可利用任何已知的合适启动子、增强子、响应元件、报告元件、隔绝元件、聚腺苷酸化信号和/或其它功能元件。本领域技术人员熟知合适的元件和序列。

核酸构建体

更特别地，本发明涉及核酸构建体，其包含编码BSEP的转基因，所述转基因是序列SEQ ID NO:1或2或与序列ID NO:1或2具有至少80％同一性的序列。

术语“核酸序列”和“核苷酸序列”可互换地用于指代由单体核苷酸组成或包含单体核苷酸的任何分子。核酸可以是寡核苷酸或多核苷酸。核苷酸序列可以是DNA或RNA。核苷酸序列可以化学修饰或人工合成。核苷酸序列包括肽核酸(PNA)、吗啉核酸和锁核酸(LNA)，以及乙二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)。这些序列中的每一个都通过分子骨架的变化与自然产生的DNA或RNA相区别。此外，还可以使用硫代磷酸核苷酸。其他脱氧核苷酸类似物包括可用于本发明核苷酸中的甲基磷酸酯、磷酰胺、二硫代磷酸酯、N3’P5’-磷酰胺和寡核苷酸硫代磷酸酯及其2’-O-烯丙基类似物和2’-O-甲基核糖核苷酸甲基膦酸酯。

本文所使用的术语“核酸构建体”是指通过使用重组DNA技术产生的人造核酸分子。核酸构建体是一种核酸分子，可以是单链或双链的，其被修饰成包含核酸序列的片段，这些片段以一种在自然界中不存在的方式组合和并列。核酸构建体通常是“载体”，即用于将外源性产生的DNA导入宿主细胞的核酸分子。

如本文所使用的，术语“序列同一性”或“同一性”是指两个多核苷酸序列的排列位置中匹配(相同的核酸残基)的数目。当序列比对时，通过比较序列来确定序列同一性，以便在最小化序列空位的同时最大化重叠和同一性。特别地，可以使用多个数学全局或局部比对算法中的任意一个来确定序列同一性，这取决于两个序列的长度。相似长度的序列优选地使用全局对齐算法比对(例如Needleman和Wunsch算法；Needleman和Wunsch，1970年，分子生物学杂志。；48(3)：443-53)，其在整个长度上最优地比对序列，而基本上不同长度的序列优选地使用局部比对算法比对(例如Smith和Waterman algorithm(Smith andWaterman,1981,J Theor Biol；91(2):379-80)或Altschul algorithm(Altschul SF etal.,1997,Nucleic Acids Res；25(17):3389-402.；Altschul SF et al.,2005,Bioinformatics；21(8):1451-6))。用于确定核酸序列同一性百分比的比对可以通过本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用可在internet网站上获得的可公开获得的计算机软件诸如http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/或http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/)。本领域技术人员可确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。出于本文的目的，％核酸序列同一性值是指使用成对序列比对程序EMBOSS Needle生成的值，该程序使用Needleman-Wunsch算法创建两个序列的最佳全局比对，其中所有搜索参数被设置为默认值，即Scoring matrix＝BLOSUM62，Gap open＝10，Gap extend＝0.5，End gap penalty＝假，End gap open＝10以及End gap extend＝0.5。

如本文所用，所述核酸构建体包含编码根据本发明的BSEP的转基因和表达所述编码序列所需的一个或多个控制序列。一般而言，所述核酸构建体包含编码序列和在所述编码序列之前(5’非编码序列)和之后(3’非编码序列)的调控序列，所述编码序列是表达所选基因产物所需的。因此，核酸构建体典型地包含启动子序列、编码序列和通常包含聚腺苷酸化位点和/或转录终止子的3’非翻译区。所述核酸构建体还包含其他的调控元件，例如增强子序列、促进在载体内插入DNA片段的多聚连接体序列和/或剪接信号序列。

在一个实施方案中，所述核酸构建体包含启动子。所述启动子在导入宿主细胞时启动转基因表达。如本文所用，术语“启动子”是指指导与其可操作连接的核酸的转录的调控元件。启动子可以调节可操作连接的核酸的转录速率和效率。启动子也可操作地连接到增强(“增强子”)或抑制(“抑制物”)核酸的启动子依赖性转录的其它调控元件。这些调控元件包括但不限于转录因子结合位点、抑制子和活化剂蛋白结合位点，以及本领域技术人员已知的直接或间接作用于调控来自启动子(包括例如衰减子、增强子，以及沉默子)的转录量的任何其他核苷酸序列。启动子位于与其可操作地连接的基因或编码序列的转录起始位点附近，在同一条链上和DNA序列的上游(朝向正义链的5’区)。启动子可以是大约100-1000个碱基对长。启动子中的位置相对于特定基因的转录起始位点被指定(即，上游位置是从-1开始倒数的负数，例如-100是上游100个碱基对的位置)。

如本文所用，术语“可操作地连接”是指功能性关系中多核苷酸(或多肽)元件的连接。当一个核酸与另一个核酸序列建立起功能性关系时，其被“可操作地连接”。例如，如果启动子或转录调控序列影响编码序列的转录，其被可操作地连接至编码序列。可操作地连接意味着被连接的DNA序列典型地是连续的；在需要连接两个蛋白质编码区的地方，它们是连续的且在阅读框中。

在具体实施方案中，本发明的核酸构建体进一步包含可操作地连接到本发明转基因的肝特异性启动子。在本发明的上下文中，“肝特异性启动子”是比在身体的任何其他组织中更活跃的在肝脏中的启动子。典型地，肝特异性启动子的活性在肝脏中要比在其他组织中大很多。例如，该启动子的活性可至少为2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或至少10倍(例如，由其在给定组织中驱动表达的能力与其在其他细胞或组织中驱动表达的能力相比而确定)。因此，肝特异性启动子允许与其相连的基因在肝脏中活性表达，并阻止其在其他细胞或组织中表达。

在一个实施方案中，肝特异性启动子包含α1抗胰蛋白酶基因启动子(AAT或A1AT)(SEQ ID NO:5)、胆盐诱导型启动子(SEQ ID NO:6或7)的核苷酸序列或嵌合启动子序列EalbPa1AT，其包含结合白蛋白基因增强子元件(Ealb)的α1抗胰蛋白酶基因启动子序列(AAT或Pa1AT)。所有这些启动子序列都具有肝特异性启动子的特性。

这些核酸构建体实施方案中的每一个还可包括聚腺苷酸化信号序列；包括或不包括其他可选的核苷酸元件。如本文所用，术语“聚腺苷酸化信号”或“poly(A)信号”是指基因的3’非翻译区(3’UTR)内的特定识别序列，其被转录成前体mRNA分子并引导基因转录的终止。Poly(A)信号是作为用于新形成的前体mRNA在其3’端的核内裂解的信号，以及作用于仅由腺嘌呤碱基组成(聚腺苷酸化过程；poly(A)尾巴)的RNA延伸的3’端的信号。Poly(A)尾巴对mRNA的核输出、翻译和稳定性具有重要意义。在本发明的上下文中，聚腺苷酸化信号是可在哺乳动物细胞中指导哺乳动物基因和/或病毒基因的聚腺苷酸化的识别序列。

Poly(A)信号典型地由以下组成：a)共有序列AAUAAA，该序列被证明是3’端切割和前信使RNA(pre mRNA)聚腺苷酸化以及促进下游转录终止所需要的，以及b)AAUAAA的上游和下游的其他元件，其控制AAUAAA作为poly(A)信号的利用效率。哺乳动物基因中的这些基序有相当大的可变性。

在一个实施方案中，本发明核酸构建体的聚腺苷酸化信号序列是哺乳动物基因或病毒基因的聚腺苷酸化信号序列。合适的聚腺苷酸化信号包括SV40早期聚腺苷酸化信号、SV40晚期聚腺苷酸化信号、HSV胸苷激酶聚腺苷酸化信号、鱼精蛋白基因聚腺苷酸化信号、腺病毒5EIb聚腺苷酸化信号、生长激素聚腺苷酸化信号、PBGD聚腺苷酸化信号、设计在硅上的(合成)聚腺苷酸化信号等。

在具体实施方案中，所述核酸构建体的聚腺苷酸化信号序列是基于兔β-珠蛋白基因的合成poly(A)信号序列，更特别地，是具有序列SEQ ID NO:8的合成poly(A)。

表达载体

本发明的核酸构建体可包含在表达载体中。如本文所用，术语“表达载体”是指用作转移遗传物质的载体的核酸分子，特别是在体外或体内将核酸递送到宿主细胞中的核酸分子。表达载体也指能够在与这种序列相容的宿主细胞或宿主生物体中影响基因(转基因)表达的核酸分子。表达载体典型地至少包括适合的转录调控序列和任选的3’-转录终止信号。还可存在影响表达所需的或有帮助的附加因子，诸如能够应答精确的诱导信号(内源性或嵌合转录因子)或特定于某些细胞、器官或组织的表达增强子元件。载体包括但不限于质粒、噬菌粒、黏粒、转座因子、病毒和人工染色体(例如YAC)。优选地，本发明的载体是适合于在基因或细胞治疗中使用的载体，并且特别适合于靶向肝细胞。

在一些实施方案中，表达载体是病毒载体，诸如衍生自莫洛尼小鼠白血病病毒载体(MoMLV)、MSCV、SFFV、MPSV或SNV的载体；慢病毒载体(例如衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)或马传染性贫血病毒(EIAV))；腺病毒(Ad)载体；腺相关病毒(AAV)载体；猴病毒40(SV-40)载体；牛乳头状瘤病毒载体，Epstein-Barr病毒；疱疹病毒载体；痘苗病毒载体；哈维小鼠肉瘤病毒载体；小鼠乳腺肿瘤病毒载体；Rous肉瘤病毒载体。

如本领域所知，取决于考虑使用的特定病毒载体，应在本发明载体中引入适合的序列以获得功能性病毒载体，诸如用于AAV载体的AAV ITR或用于慢病毒载体的LTR。在具体实施方案中，所述载体是AAV载体。

AAV作为一种潜在的人类基因治疗载体引起了广泛的关注。病毒的有利特性之一是其与任何人类疾病都没有关联，其能够感染分裂和不分裂的细胞，以及衍生自可被感染的不同组织的广泛细胞系。AAV基因组由含有4681个碱基的、线性的单链DNA分子组成(Berns和Bohenzky,1987,Advances in Virus Research(Academic Press,Inc.)32:243-307)。基因组的每一端都有反向末端重复序列(ITR)，其以顺式作为DNA复制的起点并作为用于病毒的包装信号。ITR的长度约为145bp。基因组的内部非重复部分包括两个大的开放阅读框，分别为AAV rep和cap基因。这些基因编码与病毒子复制和包装有关的病毒蛋白。特别地，从AAV rep基因合成至少四种病毒蛋白质，rep 78、rep 68、rep 52和rep 40，根据它们的表观分子量命名。AAV cap基因编码至少三种蛋白质VP1、VP2和VP3。对于AAV基因组的细节描述，见例如，Muzyczka,N.1992Current Topics in Microbiol.and Immunol.158:97-129。

因此，在一个实施方案中，包含本发明转基因的核酸构建体或表达载体进一步包含5’ITR和3’ITR序列，优选腺相关病毒的5’ITR和3’ITR序列。

如本文所用，术语“反向末端重复(ITR)”是指位于病毒的5’末端(5’ITR)的核苷酸序列和位于病毒的3’末端(3’ITR)的核苷酸序列，其包含回文序列，且可折叠形成T形发夹结构，该T形发夹结构在DNA复制起始时起到引物的作用。它们也是病毒基因组整合到宿主基因组中所需要的；为了从宿主基因组拯救；以及将病毒核酸包埋至成熟的病毒粒子。ITR是以顺式(in cis)在载体基因组复制和包装至病毒颗粒中所需的。

用于本发明病毒载体中的AAV-ITR可具有野生型核苷酸序列或可通过插入、缺失或替换而改变。AAV的反向末端重复序列(ITR)的血清型可选自任何已知的人类或非人类AAV血清型。在特定实施方案中，核酸构建体或病毒表达载体可通过使用任何AAV血清型的ITR来进行，包括AAV1、AAV2、AAV3(包括3A和3B型)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、羊AAV，以及现在已知或未来发现的任何其他AAV血清型。

在一个实施方案中，核酸构建体进一步包含血清型AAV2的AAV的5’ITR和3’ITR。

在具体实施方案中，本发明的核酸构建体包含SEQ ID NO:3或4或与SEQ ID NO:3或4具有至少80％同一性的序列或由其组成。

在一个实施方案中，根据本发明的核酸构建体或AAV载体基因组包含在重组杆状病毒基因组中。如本文所用，术语“重组杆状病毒基因组”是指包含杆状病毒遗传元件的核酸，其用于在允许杆状病毒感染和复制的宿主细胞(典型地是昆虫细胞)中自主复制重组杆状病毒基因组。术语“重组杆状病毒基因组”明确包括包含与杆状病毒异源的核酸的基因组。同样地，术语“重组杆状病毒基因组”不一定指完整的杆状病毒基因组，因为基因组可能缺少对于完成感染周期不必要的病毒序列。特别地，重组杆状病毒基因组可包括用于rAAV产生的异源AAV基因和/或诸如包封在rAAV中的密码子优化的BSEP cDNA的转基因，以用于基因治疗。用于本公开的杆状病毒遗传元件优选地从AcMNPV杆状病毒(Autographacalifornica多粒包埋型核多角体病毒)获得。

在具体实施方案中，所述第一和第二杆状病毒基因组中编码杆状病毒组织蛋白酶和几丁质酶的基因被破坏或删除。特别地，AcMNPV杆状病毒的基因v-cath(Ac127)和chiA(Ac126)可被破坏或删除，使得相应的组织蛋白酶或几丁质酶不被表达或以非活性形式被表达(即没有酶促组织蛋白酶或几丁质酶活性)。在具体实施方案中，至少对于p24基因(Ac129)、优选地对于三种杆状病毒基因p10(Ac137)、p24和p26(Ac136)，进一步破坏或删除所述重组杆状病毒基因组。在具体实施方案中，所述重组杆状病毒基因组包括功能性p74杆状病毒基因(Ac138)(即所述基因已被删除或被破坏)。

另一方面，本发明的核酸构建体或表达载体可通过使用合成的5’ITR和/或3’ITR，也可以使用来自不同血清型病毒的5’ITR和3’ITR来实现。病毒载体复制所需的所有其他病毒基因可如下所述，在病毒产生细胞(包装细胞)内以反式(in trans)提供。因此，它们包含在病毒载体中是任选的。

在一个实施方案中，本发明的核酸构建体或病毒载体包含病毒的5’ITR、ψ包装信号，和3’ITR。“ψ包装信号”是病毒基因组的顺式作用核苷酸序列，在某些病毒(例如腺病毒、慢病毒……)中，其对在复制中将病毒基因组包装到病毒衣壳中的过程是必要的。

重组AAV病毒颗粒的构建在本领域中是公知的，并且已经在例如以下中描述：US5,173,414和US5,139,941；WO 92/01070,WO 93/03769，Lebkowski et al.(1988)Molec.Cell.Biol.8:3988-3996；Vincent et al.(1990)Vaccines 90(Cold SpringHarbor Laboratory Press)；Carter,B.J.(1992)Current Opinion in Biotechnology 3:533-539；Muzyczka,N.(1992)Current Topics in Microbiol.and Immunol.158:97-129；和Kotin,R.M.(1994)Human Gene Therapy 5:793-801。

病毒颗粒

可以将本发明的核酸构建体或表达载体包装到病毒衣壳中以得到“病毒颗粒”，也称为“病毒载体颗粒”。在具体实施方案中，将本发明的核酸构建体或表达载体包装到AAV衍生的衣壳中以得到“腺相关病毒颗粒”或“AAV颗粒”。本发明涉及一种病毒颗粒，其包含本发明的核酸构建体或表达载体，且优选地包含腺相关病毒的衣壳蛋白。

术语AAV载体颗粒涵盖任何重组AAV载体颗粒或基因工程化的突变体AAV载体颗粒。重组AAV颗粒可以通过将包含衍生自特定AAV血清型的ITR的核酸构建体或病毒表达载体衣壳化到由对应于相同或不同血清型的AAV的天然或突变Cap蛋白形成的病毒颗粒上来制备。

腺相关病毒的病毒衣壳蛋白包括衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。各种AAV血清型的衣壳蛋白序列之间的差异导致使用不同的细胞表面受体进入细胞。结合其他细胞内加工途径，对每种AAV血清型，引起不同的组织趋向性。

已经发展了几种技术来修饰和改善自然产生的AAV病毒颗粒的结构和功能特性(Bünning H et al.J Gene Med,2008；10:717–733；Paulk et al.Mol ther.2018；26(1):289-303；Wang L et al.Mol Ther.2015；23(12):1877-87；Vercauteren et al.MolTher.2016；24(6):1042-1049；Zinn E et al.,Cell Rep.2015；12(6):1056-68)。

因此，在根据本公开的AAV病毒颗粒中，可以将包含给定AAV血清型的ITR的核酸构建体或病毒表达载体，例如，包装至：a)由衍生自相同或不同的AAV血清型的衣壳蛋白[例如AAV2 ITR和AAV5衣壳蛋白；AAV2 ITR和AAV8衣壳蛋白；AAV2 ITR和Anc80衣壳蛋白；AAV2ITR和AAV9衣壳蛋白]构成的病毒颗粒；b)由来自不同AAV血清型或突变体的衣壳蛋白混合物[例如AAV ITR和AAV1及AAV5衣壳蛋白]构成的镶嵌病毒颗粒；c)由通过在不同AAV血清型或变体之间进行结构域交换而被截短的衣壳蛋白[例如AAV2 ITR和具有AAV3结构域的AAV5衣壳蛋白]构成的嵌合病毒颗粒。

技术人员将理解，根据本公开使用的AAV病毒颗粒可包含来自任何AAV血清型的衣壳蛋白，包括AAV1、AAV2、AAV3(包括3A和3B型)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、绵羊AAV，合成的AAV变体(诸如NP40、NP59、NP84)(Paulk et al.Mol ther.2018.26(1):289-303)、LK03(Wang L et al.Mol Ther.2015.23(12):1877-87)、AAV3-ST(Vercauteren et al.Mol Ther.2016.24(6):1042-1049)、Anc80(Zinn E et al.,Cell Rep.2015；12(6):1056-68)和任何现在已知的或此后发现的AAV血清型。

在特定实施方案中，AAV病毒颗粒包含来自选自下组的血清型的衣壳蛋白：AAV1、AAV3B、AAV5、AAV7、AAV8和AAV9，其更适合于递送至肝细胞的(Nathwani et al.Blood2007；109:1414–1421；Kitajima et al.Atherosclerosis 2006；186:65-73)。

在具体实施方案中，AAV病毒颗粒包含来自Anc80的衣壳蛋白，Anc80是病毒AAV血清型1、2、8和9的预测祖先，其可作为靶向肝、肌肉和视网膜的高效基因治疗载体(Zinn Eet al.,Cell Rep.2015；12(6):1056-68)。在更具体的实施方案中，病毒颗粒包含Anc80L65VP3衣壳蛋白(Genbank登录号：KT235804)。

因此，在另一方面，本发明涉及病毒颗粒，其包含本发明的核酸构建体或表达载体且优选地包含腺相关病毒的衣壳蛋白(诸如来自Anc80的衣壳蛋白)。

在具体实施方案中，病毒颗粒包含在重组杆状病毒中包含的AAV载体基因组。因此，将包含AAV rep和cap的第二重组杆状病毒基因组用于产生AAV病毒颗粒。在具体实施方案中，rep和cap蛋白从不同的杆状病毒晚期启动子表达，优选以反向定向表达。在可与前述实施方案结合的特定实施方案中，第二杆状病毒基因组包括编码rep蛋白的异源核酸，例如，在杆状病毒多面体(P

病毒-聚糖相互作用是宿主细胞入侵的关键决定因素。在具体实施方案中，AAV病毒颗粒包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白包含一个或多个氨基酸取代，其中所述取代将新的聚糖结合位点引入AAV衣壳蛋白中。在更具体的实施方案中，氨基酸取代是在AAV2中的氨基酸266，氨基酸463-475和氨基酸499-502或在AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或也包括Anc80和Anc80L65在内的任何其他AAV血清型中的相应氨基酸位置。

引入的新的聚糖结合位点可以是己糖结合位点[例如，半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glu)或岩藻糖(fuc)结合位点]；唾液酸(Sia)结合位点[例如Sia残基，诸如N-乙酰神经氨酸(NeuSAc)或N-羟乙酰神经氨酸(NeuSGc)]；或二糖结合位点，其中该二糖是连接至半乳糖的唾液酸，例如以Sia(α2,3)Gal或Sia(α2,6)Gal的形式。在国际专利公开WO2014144229和Shen等(J.Biol.Chem.2013；288(40):28814–28823)中给出了将新结合位点从AAV血清型引入另一种血清型的AAV的衣壳蛋白的详细指导。在具体实施方案中，将来自AAV9的Gal结合位点引入AAV2 VP3主链中，从而产生双聚糖结合的AAV菌株，该菌株能够使用HS和Gal受体两者进入细胞。优选地，所述双聚糖结合的AAV菌株是AAV2G9。Shen等通过直接取代参与的氨基酸残基并立即将AAV9VP3衣壳蛋白亚单元上的Gal识别位点调至AAV2VP3亚单元编码区的相应残基的侧翼，从而得到AAV2G9(AAV2 VP3编号Q464V、A467P、D469N、I470M、R471A、D472V、S474G、Y500F和S501A)。

在另一个实施方案中，根据本公开使用的病毒颗粒可以是腺病毒颗粒，诸如Ad5病毒颗粒。与AAV病毒颗粒一样，Ad病毒颗粒的衣壳蛋白也可以进行工程化，以改变它们的趋向性和细胞靶向特性，其他的腺病毒血清型也可以采用。

用于制备病毒载体的方法

可以通过常规方法和方案来制备携带如上所述的表达病毒载体的病毒颗粒，所述方法和方案的选择需考虑到为表达载体的实际实施方案和待生产的载体的病毒颗粒所选择的结构特征。

简而言之，病毒颗粒可以在宿主细胞，更特别地在特定的病毒产生细胞(包装细胞)中产生，该细胞在辅助载体或病毒或其他DNA构建体的存在下，用待包装的核酸构建体或表达载体转染。

如本文所用，术语“包装细胞”是指可以用本发明的核酸构建体或表达载体转染的细胞或细胞系，且以反式(in trans)提供了完整的复制和包装病毒载体所需的所有缺失功能。典型地，包装细胞以组成型或诱导型方式表达一种或多种所述缺失的病毒功能。所述包装细胞可以是黏附细胞或悬浮细胞。

典型地，制备病毒颗粒的方法包括以下步骤：

a)在培养基中培养包含如上所述的核酸构建体或表达载体的包装细胞；和

b)从细胞培养上清液和/或细胞内收获病毒颗粒。

可以使用常规方法来制备AAV病毒颗粒，其包括与携带转基因的本发明核酸构建体或表达载体(例如质粒)；编码rep和cap基因但不携带ITR序列的核酸构建体(例如AAV辅助质粒)；以及具有提供AAV复制所必需的腺病毒功能的第三种核酸构建体(例如质粒)共转染的瞬时细胞。AAV复制所必需的病毒基因在本文中称为病毒辅助基因。典型地，所述AAV复制所必需的基因是腺病毒辅助基因，诸如E1A、E1B、E2a、E4或VA RNA。优选地，腺病毒辅助基因是Ad5或Ad2血清型。

根据本公开的AAV颗粒的大规模生产还可以通过例如用重组杆状病毒的组合感染昆虫细胞来进行(Urabe et al.Hum.Gene Ther.2002；13:1935-1943)。SF9细胞用分别表达AAV rep、AAV cap和待包装的AAV载体的两种或三种杆状病毒载体共感染。重组杆状病毒载体将提供病毒复制和/或包装所需的病毒辅助基因功能。Smith等2009(MolecularTherapy,vol.17,no.11,pp 1888-1896)进一步描述了用于在昆虫细胞中大规模制备AAV颗粒的双重杆状病毒表达系统。

合适的培养基是本领域技术人员已知的。依据待培养的细胞的类型，组成此类培养基的成分可能会有所不同。除了营养成分外，渗透压和pH被认为是培养基的重要参数。细胞生长培养基包含本领域技术人员众所周知的多种成分，包括氨基酸、维生素、有机和无机盐、糖类来源、脂质、微量元素(CuSO

根据本公开使用的病毒载体的构建和制备的进一步指导可在用于基因治疗的病毒载体、方法和方案中找到。系列：Methods in Molecular Biology,Vol.737.Merten andAl-Rubeai(Eds.)；2011Humana Press(Springer)；GeneTherapy.M.Giacca.2010Springer-Verlag；Heilbronn R.and Weger S.Viral Vectorsfor Gene Transfer:Current Status of Gene Therapeutics.In:Drug Delivery,Handbook of Experimental Pharmacology 197；M.

宿主细胞

在另一方面，本发明涉及宿主细胞，其包含本发明的核酸构建体或表达载体。更特别地，根据本发明的宿主细胞是特异性的病毒产生细胞，也称为包装细胞，其在辅助载体或病毒或其他DNA构建体存在下用本发明的核酸构建体或表达载体转染，并以反式提供了完整复制和包装病毒颗粒所需的所有缺少的功能。所述包装细胞可以是黏附细胞或悬浮细胞。

例如，所述包装细胞可以是真核细胞，诸如哺乳动物细胞，包括猿猴、人、狗和啮齿动物细胞。人细胞的实例是PER.C6细胞(WO01/38362)、MRC-5(ATCC CCL-171)、WI-38(ATCCCCL-75)、HEK-293细胞(ATCC CRL-1573)、HeLa细胞(ATCC CCL2)和胎儿恒河猴肺细胞(ATCCCL-160)。非人的灵长类细胞的实例是Vero细胞(ATCC CCL81)、COS-1细胞(ATCC CRL-1650)或COS-7细胞(ATCC CRL-1651)。狗细胞的实例是MDCK细胞(ATCC CCL-34)。啮齿动物细胞的实例是仓鼠细胞，诸如BHK21-F、HKCC细胞或CHO细胞。

作为哺乳动物来源的替代，用于制备病毒颗粒的包装细胞可以衍生自禽类，诸如鸡、鸭、鹅、鹌鹑或野鸡。禽细胞系的实例包括禽胚胎干细胞(WO01/85938和WO03/076601)，永生化的鸭视网膜细胞(WO2005/042728)和禽胚胎干细胞衍生的细胞，包括鸡细胞(WO2006/108846)或鸭细胞，诸如EB66细胞系(WO2008/129058&WO2008/142124)。

在另一个实施方案中，细胞可以是杆状病毒感染和复制包装细胞所允许的任何细胞。在具体实施方案中，所述细胞是昆虫细胞，诸如SF9细胞(ATCC CRL-1711)、Sf21细胞(IPLB-Sf21)、MG1细胞(BTI-TN-MG1)或High Five

因此，在具体实施方案中，宿主细胞包括：

-根据本发明的包含编码BSEP的转基因的核酸构建体或表达载体(例如，根据本发明的AAV载体)，

-核酸构建体，例如编码不携带ITR序列的AAV rep和/或cap基因的质粒；和/或

-包含病毒辅助基因的核酸构建体，例如质粒或病毒。

在另一方面，本发明涉及用本发明的病毒颗粒转导的宿主细胞，并且本文所用的术语“宿主细胞”是指易受目标病毒感染并适于体外培养的任何细胞系。

本发明的宿主细胞可用于离体基因治疗目的。在该实施方案中，用本发明的病毒颗粒转导细胞，随后将其移植到患者或受试者中。移植的细胞可以具有自体、异体或异源来源。对于临床用途，通常将在良好生产规范(GMP)条件下进行细胞分离。移植前，典型地检查细胞质量以及不存在微生物或其他污染物，并可以进行肝脏预处理，诸如进行放射和/或免疫抑制治疗。此外，可以将宿主细胞与生长因子一起移植以刺激细胞增殖和/或分化，诸如肝细胞生长因子(HGF)。

在具体实施方案中，该宿主细胞用于肝脏的离体基因治疗。优选地，所述细胞是真核细胞，诸如哺乳动物细胞，这些细胞包括但不限于人类，非人类的灵长类动物，诸如猿、黑猩猩、猴和猩猩，驯养的动物，包括狗和猫，以及牲畜，诸如马、牛、猪、绵羊和山羊，或其他哺乳动物物种，包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、仓鼠等。本领域技术人员将根据要移植的患者或受试者选择更合适的细胞。

所述宿主细胞可以是具有自我更新和多能性的细胞，诸如干细胞或诱导的多能干细胞。干细胞优选是间充质干细胞。间充质干细胞(MSC)能够分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞或肌细胞中的至少一种，且可从任何类型的组织中分离。通常，MSC将从骨髓、脂肪组织、脐带或外周血中分离。获得其的方法是本领域技术人员众所周知的。诱导多能干细胞(也称为iPS细胞或iPSC)是可以直接从成年细胞得到的一种多能干细胞。Yamanaka等通过将Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc基因转移到小鼠和人成纤维细胞中，并迫使细胞表达该基因，从而诱导iPS细胞(WO 2007/069666)。Thomson等随后使用Nanog和Lin28代替Klf4和c-Myc制备了人iPS细胞(WO 2008/118820)。

所述宿主细胞也可以是肝细胞。肝细胞移植程序，包括细胞分离和随后移植到人或小鼠受体中，已描述在例如Filippi and Dhawan，Ann NY Acad Sci.2014,1315 50-55；Yoshida et al.,Gastroenterology 1996,111:1654-1660；Irani et al.MolecularTherapy 2001,3:3,302-309；和Vogel et al.J Inherit Metab Dis 2014,37:165-176中。将病毒颗粒离体转导至肝细胞的方法已描述在例如Merle et al.,Scandinavian Journalof Gastroenterology 2006,41:8,974-982中。

药物组合物

本公开的另一方面涉及药物组合物，其包含本发明的核酸构建体、表达载体、病毒颗粒或宿主细胞，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

如本文所用，术语“药学上可接受的”是指由监管机构或公认的药典(诸如欧洲药典)批准用于动物和/或人。术语“赋形剂”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂、载体或媒介物。

任何适合的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂均可用于制备药物组合物(参见，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Alfonso R.Gennaro(Editor)Mack Publishing Company,April 1997)。药物组合物典型地在生产和储存条件下是无菌的和稳定的。药物组合物可以配制成溶液(例如盐、葡萄糖溶液或缓冲溶液，或其他药学上可接受的无菌液体)、微乳液、脂质体或其他适合容纳高产品浓度的有序结构(例如微粒或纳米颗粒)。载体可以是溶剂或分散介质，包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其适合的混合物。可以例如通过使用诸如卵磷脂的包膜，通过在分散的情况下维持所需的粒径以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(诸如甘露醇、山梨醇)、或氯化钠。

通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。本发明的产品可以以控释制剂的形式施用，例如以包含缓释聚合物或其他保护产品免于快速释放的载体的组合物的形式(包括植入物和微囊递送系统)施用。例如，可以使用可生物降解和生物相容的聚合物，诸如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯、聚乳酸和聚乳酸/聚乙醇酸共聚物(PLG)。优选地，将所述药物组合物配制成溶液，更优选配制成任选缓冲的盐溶液。补充的活性化合物也可加入至本发明的药物组合物中。例如，可以在Canadian Pharmacists Association的Compendium ofPharmaceutical and Specialties(CPS)中找到有关共同施用其他治疗剂的指引。

在一个实施方案中，药物组合物是肠胃外药物组合物，包括适合于静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内施用的组合物。这些药物组合物仅是示例性的，并不限制适合于其他肠胃外和非肠胃外施用途径的药物组合物。本文所述的药物组合物可以单一单位剂量或多剂量形式包装。

治疗用途

在另一方面，本发明涉及本发明的核酸构建体、表达载体、病毒颗粒、宿主细胞或药物组合物，其在有需要的受试者中用作药物。

如本文所用，术语“受试者”或“患者”是指哺乳动物。可以从所公开的治疗方法中受益的哺乳动物物种包括但不限于人类；非人类灵长类动物，诸如猿、黑猩猩、猴子和猩猩；驯养的动物，包括狗和猫；以及家畜，诸如马、牛、猪、绵羊和山羊；或其他哺乳动物物种，包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、仓鼠等。在具体实施方案中，所述受试者是新生儿、婴儿或儿童，更特别是新生儿或婴儿。本文所用的“新生儿”是指少于28天的婴儿，且本文所用的“婴儿”是指29天至2岁的儿童。

在另一方面，本发明涉及本发明的核酸构建体、表达载体、病毒颗粒、宿主细胞或药物组合物，其用于在有需要的受试者中治疗肝脏疾病，特别是进行性家族性肝内胆汁淤积症2型(PFIC2)。

如本文所用，术语“治疗”或“处理”(treatment/treat/treating)是指旨在改善患者健康状况的任何行为，诸如治疗、阻止、预防和延缓疾病。在某些实施方案中，该术语是指改善或根除疾病或与疾病有关的症状。根据本发明，与PFIC2有关的症状的实例有肝细胞死亡、肝细胞内和血液中胆汁流量减少和胆盐积聚、严重瘙痒、持续性黄疸、发展为门脉高压、肝衰竭和肝硬化。在其他实施方案中，该术语是指最小化由于向患有这种疾病的受试者施用一种或多种治疗剂而导致的疾病的扩散或恶化。

在具体实施方案中，肝脏疾病选自下组：PFIC2、BRIC-2(良性复发性肝内胆汁淤积症2型)或ICP(妊娠肝内胆汁淤积症)、药物诱导的胆汁淤积症和短暂性新生儿胆汁淤积症。

在更具体的实施方案中，所述肝脏疾病是PFIC2。

在相关方面，本发明涉及本发明的核酸构建体、表达载体、病毒颗粒、宿主细胞或药物组合物在制备用于治疗肝脏疾病，优选用于治疗PFIC2的药物中的用途。

在另一方面，本发明涉及在有需要的受试者中治疗和/或预防肝脏疾病，优选PFIC2的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的核酸构建体、表达载体、病毒颗粒、宿主细胞或药物组合物。

在本发明的上下文中，“有效量”是指治疗有效量。

如本文所用，“治疗有效量”是指在达到期望的治疗结果，诸如改善或恢复胆盐向胆汁的分泌所需的剂量和时间内的有效量。本发明产品或包含它的药物组合物的治疗有效量可以根据诸如疾病状态、年龄、性别和个体体重以及该产品或药物组合物引起期望的个体反应的能力等因素而变化。可以调整剂量方案以提供最佳的治疗响应。治疗有效量也典型地是其中产品或药物组合物的任何毒性或有害作用都被治疗有益效果所抵消的量。

用本发明的产品进行的治疗可以减轻、改善或降低PFIC2的一种或多种症状的严重性。例如，治疗可以增加和/或恢复胆盐向胆汁的分泌；减少肝脏和血液中的胆盐含量，减少瘙痒，减少肝脏损害以降低血清中的转氨酶水平，因此可以减轻疾病、改善疾病或降低疾病的严重性。

本发明的产品典型地将包含在药物组合物或药品中，任选地与药物载体、稀释剂和/或佐剂组合。该组合物或药物产品包括足以提供所需治疗效果的有效量的本发明产品，以及药学上可接受的载体或赋形剂。

在一个实施方案中，用于其治疗用途的核酸构建体、表达载体、病毒颗粒、宿主细胞或药物组合物通过肠胃外途径，特别是通过静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内途径施用于受试者或患者。

在一个实施方案中，用于其治疗用途的核酸构建体、表达载体、病毒颗粒、宿主细胞或药物组合物通过间质途径施用，即通过注射到或注射入组织间隙施用。组织靶标可以是特异性的，例如肝脏组织，或者可以是几种组织的组合，例如肌肉和肝脏组织。示例性的组织靶标可以包括肝、骨骼肌、心肌、脂肪沉积物、肾脏、肺、血管内皮、上皮和/或造血细胞。在优选实施方案中，通过肝内注射，即注射到肝组织的间隙空间中来施用。

施用于受试者或患者的本发明产品的量可根据个体受试者或患者的特定情况(包括个体的年龄、性别和体重)；疾病的性质和阶段，疾病的危害性；施用途径；和/或已向受试者或患者开出的伴随用药而变化。可以调整剂量方案以提供最佳的治疗响应。

对于任何特定的受试者，可以根据个体需要和施用或监督组合物施用的人的专业判断，随时间调整特定的剂量方案。本文阐述的剂量范围仅是示例性的，并不限制医生可以选择的剂量范围。

在一个实施方案中，可以将根据本发明的AAV病毒颗粒以5×10

试剂盒

在另一方面，本发明进一步涉及试剂盒，其在一个或多个容器中包含本发明的核酸构建体、表达载体、宿主细胞、病毒颗粒或药物组合物。试剂盒可包括说明或包装材料，其描述了如何将试剂盒中包含的核酸构建体、表达载体、病毒颗粒、宿主细胞或药物组合物施用于患者。试剂盒的容器可以是任何适合的材料，例如玻璃、塑料、金属等，且可以是任何适合的尺寸、形状或构造。在某些实施方案中，试剂盒可以包括一个或多个安瓿瓶或注射器，其以适合的液体或溶液形式容纳本发明的产品。

通过举例的方式提供以下实施例，它们并不旨在限制本发明。此外，本发明涵盖本文描述的具体和优选实施例的所有可能的组合。

具体实施方式

含有在α-1抗胰蛋白酶(A1AT)启动子下游带有人ABCB11 cDNA的AAV载体基因组的质粒的分子工程化。

使用人ATP结合盒亚家族B成员11(ABCB11)基因，也称为胆盐输出泵(hBSEP)基因，cDNA序列(3,963bp)得到两个质粒，从而允许进一步的带有野生型hBSEP cDNA或其密码子优化版本的AAV颗粒产生。对于这两种质粒，将cDNA序列克隆到A1AT启动子的下游，然后使用pAAV2质粒(Agilent Technologies,Sant Clara,CA)将该表达盒进一步插入至AAV2 DNA主链。

为了得到带有co-hBSEP的质粒，得到了合成的DNA盒(GeneScript,Piscataway,NJ)，其在基于人ABCB11蛋白(NCBI Reference Sequence:NP_003733.2)的密码子优化的hBSEP cDNA序列上游包含A1AT启动子。然后，将该盒插入AAV2质粒主链(pAAV2)的两个内部末端重复序列(ITR)之间，得到pAAV-co-hBSEP。所得的AAV-co-hBSEP载体基因组大小为4,734b，在AAV颗粒的包装范围内。通过测序和限制酶分析来控制pAAV-co-hBSEP。该质粒允许得到任何血清型或衣壳变体的AAV-co-hBSEP载体。

带有野生型hBSEP(wt-hBSEP)cDNA的质粒是通过在pAAV-co-hBSEP中用相同长度的含有the wt-hBSEP cDNA(NCBI Reference Sequence:NM_003742.4)的序列取代含有co-hBSEP cDNA的Sal I-Nde I片段(4,004bp)而得到。该最后的序列也被合成(GeneScript)并克隆到pAAV2质粒中。这种克隆存在困难，且只能通过在30℃而非37℃的条件下培养细菌菌落来实现，因为后者温度会导致不期望的质粒重排。通过测序和限制性分析验证所得的包含AAV-wt-hBSEP载体序列(4,734pb)的pAAV-wt-hBSEP质粒。该质粒允许得到任何血清型或衣壳变体的AAV-wt-hBSEP载体。

两个AAVAnc80载体(相同长度)的示意图显示在图1中。

分析人肝细胞中的BSEP表达

使用lipofectamin 2000用质粒pAAV-co-hBSEP和pAAV-wt-hBSEP转染Huh-7和HepG2细胞。将细胞固定48-72h，并使用对BSEP具有特异性的小鼠一抗通过免疫荧光检测人BSEP(Santa Cruz sc-74500；工作稀释度为1:1500)(图2)。使用驴抗小鼠IgG Alexa-488偶联的二抗(Invitrogene ref.A21202；工作稀释度为1:1,000)进行检测。如图2所示，两种质粒都可以在两种细胞系中表达特异性hBSEP，大多数细胞显示出该蛋白的膜定位。

制备含有表达hBSEP的ABCB11 cDNA的AAVAnc80病毒颗粒

发明人基于计算机设计的AAV祖先序列Anc80制备AAV载体(Zinn,E.,et al.CellReports,2015；12:1056-1068)。为制备AAVAnc80病毒颗粒(VP)，使用聚乙烯亚胺(PEI)，用30个含有融合性HEK293T细胞单层的150-cm

每个载体得到了几批，其滴度列于表1。预料不到的是，AAVAnc80-wt-hBSEP很难制备，只有六分之一得到的原液具有足够的滴度，以适于在体内应用(5x10

表1.AAVAnc80-hBSEP病毒原液的滴度*

*滴度<5x10

评估注射AAVAnc80颗粒的Abcb11

为测试hBSEP在体内的表达，发明人使用了不表达BSEP的Abcb11基因的C57BL/6敲除小鼠模型(Abcb11

最后，使用与辣根过氧化物酶(Santa Cruz sc-74500)缀合的BSEP特异性抗体，通过免疫组织化学分析了肝脏样品中的hBSEP表达。该分析表明已接受AAVAnc80-co-hBSEP载体的Abcb11

AAVAnc80-co-hBSEP在Abcb11

对于该实验，发明人使用了Abcb11

使用眼眶后途径，向四周龄的Abcb11

AAVAnc80-co-hBSEP处理的Abcb11

在这项研究中，发明人使用了Abcb11

AAV8-co-hBSEP也可诱导Abcb11

一旦发明人证明了AAVAnc80-co-hBSEP可以在Abcb11

结论

根据这些结果，发明人可以得出结论，从具有Anc80或8种血清型的AAV载体中肝脏递送人BSEP基因的密码子优化版本会在临床相关的PFIC2疾病动物模型中产生长期的治疗效果。具体地，AAVAnc80-co-hBSEP和AAV8-co-hBSEP载体均能够部分恢复肝脏的胆盐的分泌，从而控制转氨酶和胆红素水平，以及经处理的小鼠的肝脏生长。

用于实施本发明的序列

用于实施本发明的序列描述如下：

编码BSEP的密码子优化序列(co-BSEP)：(SEQ ID NO:1)

ATGAGCGACTCCGTGATTCTGAGATCAATCAAAAAATTCGGCGAAGAAAATGACGGGTTCGAGAGCGATAAATCCTATAATAATGACAAGAAGTCTAGGCTGCAGGACGAGAAGAAGGGCGATGGCGTGCGGGTGGGCTTCTTTCAGCTGTTCCGGTTCAGCAGCAGCACCGACATCTGGCTGATGTTTGTGGGCAGCCTGTGCGCCTTCCTGCACGGCATCGCACAGCCAGGCGTGCTGCTGATCTTTGGCACCATGACAGACGTGTTCATCGACTACGATGTGGAGCTGCAGGAGCTGCAGATCCCTGGCAAAGCCTGCGTGAACAATACCATCGTGTGGACAAACAGCTCCCTGAACCAGAATATGACCAACGGCACACGCTGTGGCCTGCTGAATATCGAGTCTGAGATGATCAAGTTTGCCAGCTACTATGCAGGAATCGCAGTGGCCGTGCTGATCACCGGCTACATCCAGATTTGCTTCTGGGTCATCGCAGCAGCAAGGCAGATCCAGAAGATGAGAAAGTTCTATTTTCGGAGAATCATGCGGATGGAGATCGGCTGGTTTGACTGTAACTCTGTGGGCGAGCTGAATACAAGATTCAGCGACGACATCAACAAGATCAATGACGCCATCGCCGATCAGATGGCCCTGTTTATCCAGCGGATGACCAGCACAATCTGTGGCTTCCTGCTGGGCTTCTTTAGAGGCTGGAAGCTGACCCTGGTCATCATCAGCGTGTCCCCACTGATCGGAATCGGAGCAGCAACAATCGGCCTGTCTGTGAGCAAGTTCACCGACTACGAGCTGAAAGCCTACGCCAAGGCAGGAGTGGTGGCAGATGAAGTGATCAGCAGCATGAGGACCGTGGCAGCCTTTGGCGGAGAGAAGAGGGAGGTGGAGCGGTACGAGAAGAACCTGGTGTTCGCCCAGCGGTGGGGCATCAGAAAGGGCATCGTGATGGGCTTCTTTACAGGCTTCGTGTGGTGCCTGATCTTCCTGTGCTACGCCCTGGCCTTTTGGTATGGCTCCACCCTGGTGCTGGACGAGGGAGAGTATACCCCTGGCACACTGGTGCAGATTTTCCTGAGCGTGATCGTGGGCGCCCTGAACCTGGGAAATGCATCCCCATGCCTGGAAGCCTTCGCCACAGGAAGGGCAGCAGCCACCTCCATCTTCGAGACAATCGACCGCAAGCCTATCATCGACTGTATGTCTGAGGATGGCTACAAGCTGGACAGGATCAAGGGCGAGATCGAGTTTCACAATGTGACCTTCCACTATCCCAGCCGCCCTGAGGTGAAGATCCTGAACGATCTGAATATGGTCATCAAGCCAGGAGAGATGACCGCCCTGGTGGGACCCTCTGGAGCAGGCAAGAGCACCGCCCTGCAGCTGATCCAGCGGTTTTACGACCCTTGCGAGGGAATGGTGACCGTGGACGGACACGACATCAGGTCCCTGAACATCCAGTGGCTGCGCGATCAGATCGGCATCGTGGAGCAGGAGCCAGTGCTGTTCTCTACCACAATCGCCGAGAATATCAGATACGGCCGCGAGGATGCCACAATGGAGGACATCGTGCAGGCCGCCAAGGAGGCCAACGCCTATAACTTCATCATGGATCTGCCCCAGCAGTTCGACACCCTGGTGGGAGAGGGAGGAGGACAGATGTCCGGAGGCCAGAAGCAGAGAGTGGCCATCGCCAGAGCCCTGATCCGCAACCCTAAGATCCTGCTGCTGGATATGGCCACAAGCGCCCTGGACAATGAGTCCGAGGCTATGGTGCAGGAGGTGCTGAGCAAGATCCAGCACGGCCACACCATCATCTCTGTGGCACACAGGCTGAGCACAGTGAGAGCAGCCGACACCATCATCGGCTTTGAGCACGGCACAGCAGTGGAGAGGGGCACCCACGAGGAGCTGCTGGAGAGGAAGGGCGTGTACTTCACCCTGGTGACACTGCAGTCCCAGGGCAACCAGGCCCTGAATGAGGAGGACATCAAGGATGCCACAGAGGACGATATGCTGGCCCGGACCTTCAGCAGAGGCTCCTATCAGGATTCTCTGAGGGCCAGCATCAGGCAGCGGAGCAAGTCTCAGCTGAGCTACCTGGTGCACGAGCCACCTCTGGCAGTGGTGGACCACAAGTCCACCTATGAGGAGGATCGCAAGGACAAGGACATCCCAGTGCAGGAGGAGGTGGAGCCTGCACCAGTGAGGCGCATCCTGAAGTTTTCCGCCCCAGAGTGGCCCTACATGCTGGTGGGATCTGTGGGAGCAGCAGTGAACGGCACCGTGACACCACTGTATGCCTTCCTGTTTTCCCAGATCCTGGGCACCTTCTCTATCCCCGACAAGGAGGAGCAGCGGTCCCAGATCAATGGCGTGTGCCTGCTGTTTGTGGCTATGGGCTGCGTGAGCCTGTTTACACAGTTCCTGCAGGGCTACGCCTTCGCCAAGAGCGGCGAGCTGCTGACCAAGCGGCTGAGAAAGTTCGGCTTTAGAGCCATGCTGGGCCAGGACATCGCCTGGTTTGACGATCTGCGGAACAGCCCAGGCGCCCTGACCACAAGACTGGCCACAGATGCATCTCAGGTGCAGGGAGCAGCAGGCAGCCAGATCGGCATGATCGTGAACTCCTTCACCAATGTGACAGTGGCCATGATCATCGCCTTCAGCTTTTCCTGGAAGCTGAGCCTGGTCATCCTGTGCTTCTTCCCCTTTCTGGCCCTGAGCGGAGCAACCCAGACAAGGATGCTGACCGGCTTCGCCTCCAGAGACAAGCAGGCCCTGGAGATGGTGGGCCAGATCACAAACGAGGCCCTGAGCAATATCAGGACCGTGGCAGGAATCGGCAAGGAGCGGCGGTTCATCGAGGCCCTGGAGACAGAGCTGGAGAAGCCTTTCAAGACCGCCATCCAGAAGGCCAACATCTACGGCTTCTGCTTTGCCTTCGCCCAGTGTATCATGTTCATCGCCAACTCTGCCAGCTACCGCTATGGCGGCTACCTGATCAGCAATGAGGGCCTGCACTTCAGCTACGTGTTCAGAGTGATCAGCGCCGTGGTGCTGTCTGCCACAGCCCTGGGAAGGGCCTTCTCCTACACCCCATCTTATGCCAAGGCCAAGATCAGCGCCGCCAGGTTCTTTCAGCTGCTGGACCGCCAGCCACCCATCAGCGTGTACAACACAGCCGGCGAGAAGTGGGATAATTTCCAGGGCAAGATCGACTTTGTGGATTGCAAGTTCACCTATCCTAGCAGACCAGACTCCCAGGTGCTGAATGGCCTGTCCGTGTCTATCAGCCCAGGCCAGACACTGGCCTTTGTGGGCTCCTCTGGCTGTGGCAAGTCCACCTCTATCCAGCTGCTGGAGCGGTTCTATGACCCCGATCAGGGCAAAGTGATGATCGACGGCCACGATAGCAAGAAGGTGAACGTGCAGTTTCTGAGATCCAATATCGGCATCGTGTCTCAGGAGCCTGTGCTGTTCGCCTGCTCCATCATGGATAACATCAAGTACGGCGACAATACAAAGGAGATCCCAATGGAGAGAGTGATCGCAGCAGCAAAGCAGGCACAGCTGCACGATTTCGTGATGTCCCTGCCCGAGAAGTATGAGACAAACGTGGGCTCTCAGGGCAGCCAGCTGTCCAGGGGCGAGAAGCAGAGGATCGCAATCGCCAGGGCCATCGTGCGCGATCCCAAGATCCTGCTGCTGGACGAGGCCACCAGCGCCCTGGATACAGAGTCCGAGAAGACCGTGCAGGTGGCCCTGGACAAGGCCCGGGAGGGAAGAACATGTATCGTGATCGCCCACAGACTGAGCACCATCCAGAATGCCGACATCATCGCCGTGATGGCCCAGGGCGTGGTCATCGAGAAGGGCACCCACGAGGAACTGATGGCACAGAAAGGGGCTTACTACAAACTGGTCACAACAGGCTCACCTATCTCATAG

编码BSEP#2的密码子优化序列(co-BSEP-2)(SEQ ID NO:2)

ATGTCTGATTCTGTGATCCTGAGATCCATCAAGAAATTTGGGGAAGAGAATGATGGCTTTGAGTCTGACAAGAGCTACAACAATGACAAGAAAAGCAGGCTGCAGGATGAGAAAAAGGGTGATGGTGTCAGAGTGGGCTTCTTCCAGCTGTTCAGATTCAGCAGCAGCACAGACATCTGGCTGATGTTTGTGGGCAGCCTGTGTGCCTTCCTGCATGGAATTGCTCAGCCTGGGGTGCTGCTGATCTTTGGCACCATGACAGATGTGTTCATTGACTATGATGTGGAACTGCAAGAGCTGCAGATCCCTGGCAAGGCTTGTGTGAACAACACCATTGTGTGGACCAACAGCAGCCTGAACCAGAACATGACCAATGGCACCAGATGTGGCCTGCTGAACATAGAGTCTGAGATGATCAAGTTTGCCAGCTACTATGCTGGCATTGCTGTGGCAGTGCTGATCACAGGCTACATCCAGATCTGCTTTTGGGTCATAGCTGCTGCCAGACAGATCCAGAAGATGAGGAAGTTCTACTTTAGAAGGATCATGAGGATGGAAATTGGATGGTTTGACTGCAACTCTGTGGGAGAGCTGAACACCAGATTCTCTGATGACATCAACAAGATCAATGATGCCATTGCTGACCAGATGGCCCTGTTCATCCAGAGGATGACCAGCACCATCTGTGGCTTTCTGCTGGGCTTTTTCAGAGGCTGGAAGCTGACCCTGGTTATCATCTCTGTGTCCCCACTGATTGGCATTGGAGCTGCCACCATTGGCCTGTCTGTGTCCAAGTTCACAGACTATGAGCTGAAAGCCTATGCCAAGGCTGGTGTTGTGGCTGATGAAGTGATCAGCTCCATGAGAACAGTGGCTGCCTTTGGTGGTGAAAAGAGGGAAGTTGAGAGATATGAGAAGAACCTGGTGTTTGCCCAGAGATGGGGCATCAGAAAGGGCATTGTGATGGGATTCTTCACAGGCTTTGTGTGGTGCCTGATCTTCCTGTGCTATGCCCTGGCCTTTTGGTATGGCAGCACCCTGGTTCTTGATGAAGGGGAGTACACCCCTGGAACTCTGGTGCAGATCTTTCTGTCTGTGATTGTGGGAGCCCTGAACCTGGGCAATGCCTCTCCATGTCTGGAAGCCTTTGCCACAGGCAGAGCTGCTGCTACCAGCATCTTTGAGACAATTGACAGAAAGCCCATCATTGACTGCATGTCTGAGGATGGCTACAAGCTGGACAGGATCAAAGGGGAGATTGAGTTCCACAACGTGACCTTTCACTACCCCAGCAGACCTGAAGTGAAGATCCTGAATGACCTGAACATGGTCATCAAGCCTGGGGAGATGACAGCCCTTGTGGGACCTAGTGGTGCTGGCAAATCTACAGCCCTGCAGCTGATCCAGAGATTCTATGACCCCTGTGAAGGCATGGTCACAGTGGATGGCCATGACATCAGATCTCTGAACATCCAGTGGCTGAGGGACCAGATTGGAATTGTGGAACAAGAGCCTGTGCTGTTCAGCACCACCATTGCAGAGAACATCAGATATGGCAGGGAAGATGCCACAATGGAAGATATTGTGCAGGCTGCCAAAGAGGCCAACGCCTACAACTTCATCATGGACCTGCCTCAGCAGTTTGACACCCTTGTTGGAGAGGGTGGTGGCCAAATGAGTGGTGGACAGAAACAGAGAGTGGCCATTGCTAGAGCCCTGATCAGAAACCCCAAGATCCTGCTGCTGGACATGGCTACATCTGCCCTGGACAATGAGTCTGAGGCTATGGTGCAAGAGGTGCTGAGCAAGATCCAGCATGGCCACACCATCATTAGTGTGGCCCACAGACTGAGCACAGTCAGGGCTGCTGACACAATCATTGGATTTGAGCATGGCACAGCAGTGGAAAGGGGCACCCATGAGGAACTGCTGGAAAGAAAAGGGGTCTACTTCACCCTGGTCACCCTGCAGTCTCAGGGCAATCAGGCCCTGAATGAAGAGGACATCAAGGATGCCACTGAGGATGACATGCTGGCCAGAACCTTCAGCAGAGGCAGCTACCAGGATAGCCTGAGAGCCAGCATCAGACAGAGAAGCAAGAGCCAGCTGAGCTACCTGGTGCATGAACCTCCACTGGCTGTGGTGGACCACAAGTCCACCTATGAGGAAGATAGGAAGGACAAGGACATCCCTGTGCAAGAAGAGGTGGAACCTGCTCCTGTCAGAAGAATCCTGAAGTTTTCTGCCCCTGAGTGGCCCTACATGCTTGTGGGTTCTGTTGGGGCTGCTGTGAATGGCACAGTGACCCCTCTGTATGCCTTTCTGTTCTCCCAGATCCTGGGCACCTTTAGCATCCCTGACAAAGAGGAACAGAGGTCCCAGATCAATGGTGTCTGCCTGCTCTTTGTGGCTATGGGCTGTGTGTCCCTGTTTACCCAGTTCCTGCAGGGATATGCCTTTGCTAAGAGTGGGGAGCTGCTCACAAAGAGGCTGAGAAAGTTTGGCTTCAGAGCCATGCTTGGCCAGGACATTGCTTGGTTTGATGACCTGAGAAACAGCCCTGGGGCTCTGACCACAAGACTGGCTACAGATGCTAGCCAGGTGCAGGGTGCAGCAGGCAGCCAAATTGGCATGATTGTGAACAGCTTCACCAATGTGACAGTGGCCATGATCATTGCCTTCAGCTTCAGCTGGAAACTGAGCCTTGTGATCCTCTGCTTCTTCCCCTTTCTGGCCCTGTCTGGGGCTACCCAGACAAGAATGCTGACTGGCTTTGCCTCCAGAGACAAGCAGGCCCTGGAAATGGTTGGACAGATCACCAATGAGGCCCTGTCCAACATCAGGACAGTGGCAGGCATTGGCAAAGAGAGAAGATTCATTGAGGCCCTTGAGACAGAGCTTGAGAAGCCCTTCAAGACAGCCATCCAGAAAGCTAACATCTATGGGTTCTGCTTTGCTTTTGCCCAGTGCATCATGTTCATTGCCAACTCAGCCAGCTACAGATATGGTGGCTACCTGATCTCTAATGAGGGCCTGCACTTCAGCTATGTGTTCAGAGTGATCTCTGCTGTGGTGCTGTCTGCCACTGCTCTGGGCAGAGCCTTTAGCTACACCCCTAGCTATGCCAAAGCCAAGATCTCTGCAGCCAGATTCTTTCAGCTGCTGGATAGACAGCCTCCTATCAGTGTGTACAACACAGCTGGGGAGAAGTGGGACAACTTCCAGGGCAAGATTGACTTTGTGGATTGCAAGTTCACCTATCCTAGCAGACCAGACTCTCAGGTGCTGAATGGACTGAGTGTGTCTATCAGCCCTGGCCAGACACTGGCCTTTGTGGGAAGCTCTGGATGTGGCAAGAGCACCAGCATCCAGCTGCTTGAGAGGTTCTATGATCCAGACCAGGGCAAAGTGATGATTGATGGGCATGACAGCAAGAAAGTGAATGTGCAGTTCCTGAGGTCCAACATTGGGATTGTGTCCCAAGAACCTGTTCTGTTTGCCTGCAGCATCATGGATAACATTAAGTATGGGGACAACACCAAAGAAATCCCTATGGAAAGAGTGATTGCTGCAGCCAAGCAGGCACAGCTGCATGATTTTGTGATGAGCCTGCCTGAGAAGTATGAGACAAATGTGGGCTCCCAGGGCAGCCAGCTGTCTAGAGGGGAAAAACAGAGAATTGCCATAGCCAGGGCCATAGTCAGAGATCCTAAGATTCTGCTCCTGGATGAGGCCACCTCTGCTCTGGATACAGAGTCTGAAAAGACAGTCCAGGTGGCACTGGACAAGGCCAGAGAGGGCAGAACCTGTATTGTGATTGCCCATAGGCTGTCCACAATCCAAAATGCTGACATCATTGCAGTGATGGCCCAAGGGGTTGTGATTGAGAAGGGAACACATGAAGAACTCATGGCCCAAAAAGGGGCCTATTATAAGCTGGTCACCACTGGCAGCCCCATCAGCTAG

包含编码BSEP的密码子优化序列的重组AAV载体(rAAV-co-hBSEP)(SEQ ID NO:3)

CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCGAATTCCATGGTACCAGGCATCAAGACACGTGCGCCACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAAGGCCTGTCGACGGATCCGAGCTCGCCGCCACCATGAGCGACTCCGTGATTCTGAGATCAATCAAAAAATTCGGCGAAGAAAATGACGGGTTCGAGAGCGATAAATCCTATAATAATGACAAGAAGTCTAGGCTGCAGGACGAGAAGAAGGGCGATGGCGTGCGGGTGGGCTTCTTTCAGCTGTTCCGGTTCAGCAGCAGCACCGACATCTGGCTGATGTTTGTGGGCAGCCTGTGCGCCTTCCTGCACGGCATCGCACAGCCAGGCGTGCTGCTGATCTTTGGCACCATGACAGACGTGTTCATCGACTACGATGTGGAGCTGCAGGAGCTGCAGATCCCTGGCAAAGCCTGCGTGAACAATACCATCGTGTGGACAAACAGCTCCCTGAACCAGAATATGACCAACGGCACACGCTGTGGCCTGCTGAATATCGAGTCTGAGATGATCAAGTTTGCCAGCTACTATGCAGGAATCGCAGTGGCCGTGCTGATCACCGGCTACATCCAGATTTGCTTCTGGGTCATCGCAGCAGCAAGGCAGATCCAGAAGATGAGAAAGTTCTATTTTCGGAGAATCATGCGGATGGAGATCGGCTGGTTTGACTGTAACTCTGTGGGCGAGCTGAATACAAGATTCAGCGACGACATCAACAAGATCAATGACGCCATCGCCGATCAGATGGCCCTGTTTATCCAGCGGATGACCAGCACAATCTGTGGCTTCCTGCTGGGCTTCTTTAGAGGCTGGAAGCTGACCCTGGTCATCATCAGCGTGTCCCCACTGATCGGAATCGGAGCAGCAACAATCGGCCTGTCTGTGAGCAAGTTCACCGACTACGAGCTGAAAGCCTACGCCAAGGCAGGAGTGGTGGCAGATGAAGTGATCAGCAGCATGAGGACCGTGGCAGCCTTTGGCGGAGAGAAGAGGGAGGTGGAGCGGTACGAGAAGAACCTGGTGTTCGCCCAGCGGTGGGGCATCAGAAAGGGCATCGTGATGGGCTTCTTTACAGGCTTCGTGTGGTGCCTGATCTTCCTGTGCTACGCCCTGGCCTTTTGGTATGGCTCCACCCTGGTGCTGGACGAGGGAGAGTATACCCCTGGCACACTGGTGCAGATTTTCCTGAGCGTGATCGTGGGCGCCCTGAACCTGGGAAATGCATCCCCATGCCTGGAAGCCTTCGCCACAGGAAGGGCAGCAGCCACCTCCATCTTCGAGACAATCGACCGCAAGCCTATCATCGACTGTATGTCTGAGGATGGCTACAAGCTGGACAGGATCAAGGGCGAGATCGAGTTTCACAATGTGACCTTCCACTATCCCAGCCGCCCTGAGGTGAAGATCCTGAACGATCTGAATATGGTCATCAAGCCAGGAGAGATGACCGCCCTGGTGGGACCCTCTGGAGCAGGCAAGAGCACCGCCCTGCAGCTGATCCAGCGGTTTTACGACCCTTGCGAGGGAATGGTGACCGTGGACGGACACGACATCAGGTCCCTGAACATCCAGTGGCTGCGCGATCAGATCGGCATCGTGGAGCAGGAGCCAGTGCTGTTCTCTACCACAATCGCCGAGAATATCAGATACGGCCGCGAGGATGCCACAATGGAGGACATCGTGCAGGCCGCCAAGGAGGCCAACGCCTATAACTTCATCATGGATCTGCCCCAGCAGTTCGACACCCTGGTGGGAGAGGGAGGAGGACAGATGTCCGGAGGCCAGAAGCAGAGAGTGGCCATCGCCAGAGCCCTGATCCGCAACCCTAAGATCCTGCTGCTGGATATGGCCACAAGCGCCCTGGACAATGAGTCCGAGGCTATGGTGCAGGAGGTGCTGAGCAAGATCCAGCACGGCCACACCATCATCTCTGTGGCACACAGGCTGAGCACAGTGAGAGCAGCCGACACCATCATCGGCTTTGAGCACGGCACAGCAGTGGAGAGGGGCACCCACGAGGAGCTGCTGGAGAGGAAGGGCGTGTACTTCACCCTGGTGACACTGCAGTCCCAGGGCAACCAGGCCCTGAATGAGGAGGACATCAAGGATGCCACAGAGGACGATATGCTGGCCCGGACCTTCAGCAGAGGCTCCTATCAGGATTCTCTGAGGGCCAGCATCAGGCAGCGGAGCAAGTCTCAGCTGAGCTACCTGGTGCACGAGCCACCTCTGGCAGTGGTGGACCACAAGTCCACCTATGAGGAGGATCGCAAGGACAAGGACATCCCAGTGCAGGAGGAGGTGGAGCCTGCACCAGTGAGGCGCATCCTGAAGTTTTCCGCCCCAGAGTGGCCCTACATGCTGGTGGGATCTGTGGGAGCAGCAGTGAACGGCACCGTGACACCACTGTATGCCTTCCTGTTTTCCCAGATCCTGGGCACCTTCTCTATCCCCGACAAGGAGGAGCAGCGGTCCCAGATCAATGGCGTGTGCCTGCTGTTTGTGGCTATGGGCTGCGTGAGCCTGTTTACACAGTTCCTGCAGGGCTACGCCTTCGCCAAGAGCGGCGAGCTGCTGACCAAGCGGCTGAGAAAGTTCGGCTTTAGAGCCATGCTGGGCCAGGACATCGCCTGGTTTGACGATCTGCGGAACAGCCCAGGCGCCCTGACCACAAGACTGGCCACAGATGCATCTCAGGTGCAGGGAGCAGCAGGCAGCCAGATCGGCATGATCGTGAACTCCTTCACCAATGTGACAGTGGCCATGATCATCGCCTTCAGCTTTTCCTGGAAGCTGAGCCTGGTCATCCTGTGCTTCTTCCCCTTTCTGGCCCTGAGCGGAGCAACCCAGACAAGGATGCTGACCGGCTTCGCCTCCAGAGACAAGCAGGCCCTGGAGATGGTGGGCCAGATCACAAACGAGGCCCTGAGCAATATCAGGACCGTGGCAGGAATCGGCAAGGAGCGGCGGTTCATCGAGGCCCTGGAGACAGAGCTGGAGAAGCCTTTCAAGACCGCCATCCAGAAGGCCAACATCTACGGCTTCTGCTTTGCCTTCGCCCAGTGTATCATGTTCATCGCCAACTCTGCCAGCTACCGCTATGGCGGCTACCTGATCAGCAATGAGGGCCTGCACTTCAGCTACGTGTTCAGAGTGATCAGCGCCGTGGTGCTGTCTGCCACAGCCCTGGGAAGGGCCTTCTCCTACACCCCATCTTATGCCAAGGCCAAGATCAGCGCCGCCAGGTTCTTTCAGCTGCTGGACCGCCAGCCACCCATCAGCGTGTACAACACAGCCGGCGAGAAGTGGGATAATTTCCAGGGCAAGATCGACTTTGTGGATTGCAAGTTCACCTATCCTAGCAGACCAGACTCCCAGGTGCTGAATGGCCTGTCCGTGTCTATCAGCCCAGGCCAGACACTGGCCTTTGTGGGCTCCTCTGGCTGTGGCAAGTCCACCTCTATCCAGCTGCTGGAGCGGTTCTATGACCCCGATCAGGGCAAAGTGATGATCGACGGCCACGATAGCAAGAAGGTGAACGTGCAGTTTCTGAGATCCAATATCGGCATCGTGTCTCAGGAGCCTGTGCTGTTCGCCTGCTCCATCATGGATAACATCAAGTACGGCGACAATACAAAGGAGATCCCAATGGAGAGAGTGATCGCAGCAGCAAAGCAGGCACAGCTGCACGATTTCGTGATGTCCCTGCCCGAGAAGTATGAGACAAACGTGGGCTCTCAGGGCAGCCAGCTGTCCAGGGGCGAGAAGCAGAGGATCGCAATCGCCAGGGCCATCGTGCGCGATCCCAAGATCCTGCTGCTGGACGAGGCCACCAGCGCCCTGGATACAGAGTCCGAGAAGACCGTGCAGGTGGCCCTGGACAAGGCCCGGGAGGGAAGAACATGTATCGTGATCGCCCACAGACTGAGCACCATCCAGAATGCCGACATCATCGCCGTGATGGCCCAGGGCGTGGTCATCGAGAAGGGCACCCACGAGGAACTGATGGCACAGAAAGGGGCTTACTACAAACTGGTCACAACAGGCTCACCTATCTCATAGGGATCCATATGATATCAATAAAGACCTCTTATTTTCATTCATCAGGTGTGGTTGGTTTTTTTGTGTGGGGGCTCGAGATCTGAGGAACCCCTAGTGATGGAGGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAG

包含编码BSEP#2的密码子优化序列的重组AAV载体(rAAV-co-hBSEP-2)(SEQ IDNO:4)

CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCGAATTCCATGGTACCAGGCATCAAGACACGTGCGCCACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAAGGCCTGTCGACGGATCCGAGCTCGCCGCCACCATGTCTGATTCTGTGATCCTGAGATCCATCAAGAAATTTGGGGAAGAGAATGATGGCTTTGAGTCTGACAAGAGCTACAACAATGACAAGAAAAGCAGGCTGCAGGATGAGAAAAAGGGTGATGGTGTCAGAGTGGGCTTCTTCCAGCTGTTCAGATTCAGCAGCAGCACAGACATCTGGCTGATGTTTGTGGGCAGCCTGTGTGCCTTCCTGCATGGAATTGCTCAGCCTGGGGTGCTGCTGATCTTTGGCACCATGACAGATGTGTTCATTGACTATGATGTGGAACTGCAAGAGCTGCAGATCCCTGGCAAGGCTTGTGTGAACAACACCATTGTGTGGACCAACAGCAGCCTGAACCAGAACATGACCAATGGCACCAGATGTGGCCTGCTGAACATAGAGTCTGAGATGATCAAGTTTGCCAGCTACTATGCTGGCATTGCTGTGGCAGTGCTGATCACAGGCTACATCCAGATCTGCTTTTGGGTCATAGCTGCTGCCAGACAGATCCAGAAGATGAGGAAGTTCTACTTTAGAAGGATCATGAGGATGGAAATTGGATGGTTTGACTGCAACTCTGTGGGAGAGCTGAACACCAGATTCTCTGATGACATCAACAAGATCAATGATGCCATTGCTGACCAGATGGCCCTGTTCATCCAGAGGATGACCAGCACCATCTGTGGCTTTCTGCTGGGCTTTTTCAGAGGCTGGAAGCTGACCCTGGTTATCATCTCTGTGTCCCCACTGATTGGCATTGGAGCTGCCACCATTGGCCTGTCTGTGTCCAAGTTCACAGACTATGAGCTGAAAGCCTATGCCAAGGCTGGTGTTGTGGCTGATGAAGTGATCAGCTCCATGAGAACAGTGGCTGCCTTTGGTGGTGAAAAGAGGGAAGTTGAGAGATATGAGAAGAACCTGGTGTTTGCCCAGAGATGGGGCATCAGAAAGGGCATTGTGATGGGATTCTTCACAGGCTTTGTGTGGTGCCTGATCTTCCTGTGCTATGCCCTGGCCTTTTGGTATGGCAGCACCCTGGTTCTTGATGAAGGGGAGTACACCCCTGGAACTCTGGTGCAGATCTTTCTGTCTGTGATTGTGGGAGCCCTGAACCTGGGCAATGCCTCTCCATGTCTGGAAGCCTTTGCCACAGGCAGAGCTGCTGCTACCAGCATCTTTGAGACAATTGACAGAAAGCCCATCATTGACTGCATGTCTGAGGATGGCTACAAGCTGGACAGGATCAAAGGGGAGATTGAGTTCCACAACGTGACCTTTCACTACCCCAGCAGACCTGAAGTGAAGATCCTGAATGACCTGAACATGGTCATCAAGCCTGGGGAGATGACAGCCCTTGTGGGACCTAGTGGTGCTGGCAAATCTACAGCCCTGCAGCTGATCCAGAGATTCTATGACCCCTGTGAAGGCATGGTCACAGTGGATGGCCATGACATCAGATCTCTGAACATCCAGTGGCTGAGGGACCAGATTGGAATTGTGGAACAAGAGCCTGTGCTGTTCAGCACCACCATTGCAGAGAACATCAGATATGGCAGGGAAGATGCCACAATGGAAGATATTGTGCAGGCTGCCAAAGAGGCCAACGCCTACAACTTCATCATGGACCTGCCTCAGCAGTTTGACACCCTTGTTGGAGAGGGTGGTGGCCAAATGAGTGGTGGACAGAAACAGAGAGTGGCCATTGCTAGAGCCCTGATCAGAAACCCCAAGATCCTGCTGCTGGACATGGCTACATCTGCCCTGGACAATGAGTCTGAGGCTATGGTGCAAGAGGTGCTGAGCAAGATCCAGCATGGCCACACCATCATTAGTGTGGCCCACAGACTGAGCACAGTCAGGGCTGCTGACACAATCATTGGATTTGAGCATGGCACAGCAGTGGAAAGGGGCACCCATGAGGAACTGCTGGAAAGAAAAGGGGTCTACTTCACCCTGGTCACCCTGCAGTCTCAGGGCAATCAGGCCCTGAATGAAGAGGACATCAAGGATGCCACTGAGGATGACATGCTGGCCAGAACCTTCAGCAGAGGCAGCTACCAGGATAGCCTGAGAGCCAGCATCAGACAGAGAAGCAAGAGCCAGCTGAGCTACCTGGTGCATGAACCTCCACTGGCTGTGGTGGACCACAAGTCCACCTATGAGGAAGATAGGAAGGACAAGGACATCCCTGTGCAAGAAGAGGTGGAACCTGCTCCTGTCAGAAGAATCCTGAAGTTTTCTGCCCCTGAGTGGCCCTACATGCTTGTGGGTTCTGTTGGGGCTGCTGTGAATGGCACAGTGACCCCTCTGTATGCCTTTCTGTTCTCCCAGATCCTGGGCACCTTTAGCATCCCTGACAAAGAGGAACAGAGGTCCCAGATCAATGGTGTCTGCCTGCTCTTTGTGGCTATGGGCTGTGTGTCCCTGTTTACCCAGTTCCTGCAGGGATATGCCTTTGCTAAGAGTGGGGAGCTGCTCACAAAGAGGCTGAGAAAGTTTGGCTTCAGAGCCATGCTTGGCCAGGACATTGCTTGGTTTGATGACCTGAGAAACAGCCCTGGGGCTCTGACCACAAGACTGGCTACAGATGCTAGCCAGGTGCAGGGTGCAGCAGGCAGCCAAATTGGCATGATTGTGAACAGCTTCACCAATGTGACAGTGGCCATGATCATTGCCTTCAGCTTCAGCTGGAAACTGAGCCTTGTGATCCTCTGCTTCTTCCCCTTTCTGGCCCTGTCTGGGGCTACCCAGACAAGAATGCTGACTGGCTTTGCCTCCAGAGACAAGCAGGCCCTGGAAATGGTTGGACAGATCACCAATGAGGCCCTGTCCAACATCAGGACAGTGGCAGGCATTGGCAAAGAGAGAAGATTCATTGAGGCCCTTGAGACAGAGCTTGAGAAGCCCTTCAAGACAGCCATCCAGAAAGCTAACATCTATGGGTTCTGCTTTGCTTTTGCCCAGTGCATCATGTTCATTGCCAACTCAGCCAGCTACAGATATGGTGGCTACCTGATCTCTAATGAGGGCCTGCACTTCAGCTATGTGTTCAGAGTGATCTCTGCTGTGGTGCTGTCTGCCACTGCTCTGGGCAGAGCCTTTAGCTACACCCCTAGCTATGCCAAAGCCAAGATCTCTGCAGCCAGATTCTTTCAGCTGCTGGATAGACAGCCTCCTATCAGTGTGTACAACACAGCTGGGGAGAAGTGGGACAACTTCCAGGGCAAGATTGACTTTGTGGATTGCAAGTTCACCTATCCTAGCAGACCAGACTCTCAGGTGCTGAATGGACTGAGTGTGTCTATCAGCCCTGGCCAGACACTGGCCTTTGTGGGAAGCTCTGGATGTGGCAAGAGCACCAGCATCCAGCTGCTTGAGAGGTTCTATGATCCAGACCAGGGCAAAGTGATGATTGATGGGCATGACAGCAAGAAAGTGAATGTGCAGTTCCTGAGGTCCAACATTGGGATTGTGTCCCAAGAACCTGTTCTGTTTGCCTGCAGCATCATGGATAACATTAAGTATGGGGACAACACCAAAGAAATCCCTATGGAAAGAGTGATTGCTGCAGCCAAGCAGGCACAGCTGCATGATTTTGTGATGAGCCTGCCTGAGAAGTATGAGACAAATGTGGGCTCCCAGGGCAGCCAGCTGTCTAGAGGGGAAAAACAGAGAATTGCCATAGCCAGGGCCATAGTCAGAGATCCTAAGATTCTGCTCCTGGATGAGGCCACCTCTGCTCTGGATACAGAGTCTGAAAAGACAGTCCAGGTGGCACTGGACAAGGCCAGAGAGGGCAGAACCTGTATTGTGATTGCCCATAGGCTGTCCACAATCCAAAATGCTGACATCATTGCAGTGATGGCCCAAGGGGTTGTGATTGAGAAGGGAACACATGAAGAACTCATGGCCCAAAAAGGGGCCTATTATAAGCTGGTCACCACTGGCAGCCCCATCAGCTAGGGATCCATATGATATCAATAAAGACCTCTTATTTTCATTCATCAGGTGTGGTTGGTTTTTTTGTGTGGGGGCTCGAGATCTGAGGAACCCCTAGTGATGGAGGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAG

α1抗胰蛋白酶启动子(SEQ ID NO:5)

CGCCACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACA

人最小胆盐输出泵(ABCB11)基因启动子(SEQ ID NO:6)

TTCCCAAGCACACTCTGTGTTTGGGGTTATTGCTCTGAGTATGTTTCTCGTATGTCACTGAACTGTGCTTGGGCTGCCCTTAGGGACATTGATCCTTAGGCAAATAGATAATGTTCTTGAAAAAGTTTGAATTCTGTTCAGTGCT

小鼠最小胆盐输出泵(ABCB11)基因启动子(SEQ ID NO:7)

GGTTCCTGCTTTGAGTATGTTCGACCTTTCCTCTCATGTCACTGAACTGTGCTAGATCTGGACTTTAGGCCATTGACCTATAAGCAAATAGATAGTGTTCTTAAAAAAGCCTGATTTCTGTTCAATGCTTTATTACCATGAAAAC

合成的poly A序列(SEQ ID NO:8)

AATAAAGACCTCTTATTTTCATTCATCAGGTGTGGTTGGTTTTTTTGTGTGGGGGC