一种基于锁核酸修饰的RMA法检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的试剂盒

摘要

本申请属于生物检测技术领域，具体为一种基于锁核酸修饰的RMA法检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的试剂盒；所述引物和探针组分为两组，A组为检测CYP2C9*2和*3的引物对、野生型探针和突变型探针；B组为检测VKORC1‑1639G>A的引物对、野生型探针和突变型探针；所述试剂盒包括含有扩增反应试剂A的检测管、含有扩增反应试剂B的检测管、缓冲液、醋酸镁、阳性对照、阴性对照。

说明书

技术领域

本申请属于生物检测技术领域，具体为一种基于锁核酸修饰的RMA法检测CYP2C9和 VKORC1基因多态性的试剂盒。

背景技术

华法林是临床常用的抗凝药物，它通过抑制肝细胞中凝血因子的合成，对抗有凝血功能的维生素K的作用，降低凝血酶诱导的血小板聚集反应，从而起到抗凝作用，主要用于防治血栓栓塞性疾病。但华法林临床使用治疗窗窄，个体剂量差异大，容易导致出血不良反应。药物基因组学研究表明，VKORC1和CYP2C9基因多态性是华法林个体化治疗中最重要的因素，美国FDA建议在使用华法林前检测CYP2C9和VKORC1的基因型，以保证准确的用药量。因此，病人在首次服用华法林之前检测CYP2C9和VKORC1基因多态性，对患者的疗效获益及避免出血等不良事件的发生有重要的指导意义。

华法林在肝脏中的代谢依赖于细胞色素P450，故CYP2C9基因多态性会对华法林的剂量产生影响。CYP2C9最常见的突变是CYP2C9*2(rs1799853，430C>T)和CYP2C9*3(rs1057910， 1075A>C)，突变导致CYP2C9酶活性降低，使其底物的清除率降低，血药浓度升高，因此需降低临床用药剂量，防止不良反应的发生。亚洲人群发现的主要是CYP2C9*3突变，发生率为1％-4％，CYP2C9*2突变在亚洲人中很少出现。

VKORC1是维生素K依赖性凝血因子生成的限速酶，是华法林等香豆素类抗凝药物的作用靶点。在VKORC1编码区和非编码区存在大量的多态性位点，VKORC1启动子的基因多态性(rs9923231，-1639G>A)是影响华法林需求剂量中种族差异和个体差异的最主要因素。研究表明，VKORC1-1639G>A等位基因频率在不同种族人群分布不同，AA纯合子基因型亚洲人频率最高，非洲裔美国人频率最低，欧洲人居中，而携带纯合子突变AA基因型的患者需要的华法林剂量更低一些。

目前，针对CYP2C9和VKORC1基因多态性的检测方法很多，如荧光定量PCR法、限制性片段长度多态性分析法、高分辨率溶解曲线法、直接测序、基因芯片等。但是这些方法基本上都操作复杂、检测周期长，且需要复杂的仪器设备、成本也较高，不适合临床推广。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase MediatedAmplification,RMA)技术是一种核酸等温扩增技术，主要依赖重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶三种酶。RMA反应可以在37～42℃进行，整个过程在30min内即可达到检测水平。锁核酸(LockedNucleicAcid，LNA)是一种特殊的双环状寡核苷酸衍生物，其结构中核糖的2'-O位和4'-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃糖C3'-内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性，提高了扩增反应中DNA分子的稳定性和亲和力。研究发现，在错配位点修饰1-3个锁核酸可明显提高单碱基错配的识别能力。LNA修饰的探针比传统的DNA探针有更高的灵敏度、稳定性、扩增效率和较低的探针浓度，是一种更为可靠的检测基因分型的方法。

本发明采用锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法(LNA-RMA法)进行CYP2C9和VKORC1基因多态性检测，更加快速、简便，能够提高单碱基突变检测的特异性和灵敏度。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本申请提供了一种基于锁核酸修饰的RMA法检测CYP2C9 和VKORC1基因多态性的试剂盒，本申请是通过下述方案实现的：

一种基于锁核酸修饰的RMA法检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的的引物探针组，所述引物和探针组分为两组，A组为检测CYP2C9*2和*3的引物对、野生型探针和突变型探针；B组为检测VKORC1-1639G>A的引物对、野生型探针和突变型探针，其中，A组的 CYP2C9*2引物和探针序列为：

上游引物：5’-GATATGAAGCAGTGAAGGAAGCCCTGATTGAT-3’；

下游引物：5’-AGTAGTCCAGTAAGGTCAGTGATATGGAGTAGG-3’；

野生型探针：

突变型探针：

A组的CYP2C9*3引物和探针序列为：

上游引物：5’-CAGGAAGAGATTGAACGTGTGATTGGCAGAA-3’；

下游引物：5’-GCAGTGTAGGAGAAACAAACTTACCTTGGGAAT-3’；

野生型探针：

突变型探针：

B组的VKORC1-1639G>A引物和探针序列为：

上游引物：5’-GCAGGAGAGGGAAATATCACAGACGCCAGAG-3’；

下游引物：5’-GTTCTCGTGCCTCAGCCTCCCAAGTAGTTT-3’；

野生型探针：

突变型探针：

优选的，所述探针修饰有荧光基团和猝灭基团，所述猝灭基团修饰在THF 3’端的T碱基上，荧光基团修饰在SNP位点的5’端T碱基上或SNP位点互补碱基的5’端T碱基上。

优选的，所述荧光基团用FAM、TET、ROX或CY5修饰，所述淬灭基团都用BHQ修饰。

优选的，所述探针3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。

一种基于锁核酸修饰的RMA法检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的试剂盒，所述试剂盒包括含有扩增反应试剂A的检测管、含有扩增反应试剂B的检测管、缓冲液、醋酸镁、阳性对照、阴性对照。

优选的，所述扩增反应试剂A包括CYP2C9*2上下游引物、CYP2C9*2野生型和突变型探针、CYP2C9*3上下游引物、CYP2C9*3野生型和突变型探针、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY 蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸。

优选的，所述扩增反应试剂B包括VKORC1-1639G>A上下游引物、VKORC1-1639G>A野生型和突变型探针、大肠杆菌RecA蛋白、、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸。

优选的，所述引物对及检测探针组在扩增体系中的终浓度分别为10μM；所述聚环氧乙烷的终浓度为10％w/v；所述海藻糖的终浓度为2mM；所述甘露醇的终浓度为2.5mM；所述 ATP的终浓度为10mM；所述dNTPs的终浓度为2mM；所述肌酸激酶的终浓度为1000ng/mL；所述磷酸肌酸的终浓度为25mM；所述大肠杆菌RecA蛋白的终浓度为100ng/μL；所述UvsY 蛋白的终浓度为40ng/μL；所述单链结合蛋白GP32的终浓度为800ng/μL；所述Bst聚合酶的终浓度为60ng/μL；所述核酸外切酶III的终浓度为80ng/μL。

优选的，所述阳性对照为CYP2C9*2野生型质粒和突变型质粒、CYP2C9*3野生型质粒和突变型质粒、VKORC1-1639G>A野生型质粒和突变型质粒。

优选的，所述阴性对照为无菌双蒸水。

优选的，所述试剂盒可以检测的样品为人全血/外周血样本。

一种基于锁核酸修饰的RMA法检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测样本DNA作为模板。

(2)设计用于CYP2C9*2、CYP2C9*3和VKORC1-1639G>A基因多态性检测的引物对及探针。

(3)以提取的待测样本DNA作为模板，加入上述试剂盒中的反应试剂进行RMA扩增反应。扩增反应条件为在实时恒温荧光检测器中39℃下扩增20分钟。

(4)检测结果判定：

对于野生纯合型样本，只有野生型探针产生荧光信号，而突变型探针没有产生荧光信号，说明突变型探针对野生型模板不会产生非特异性扩增；对于突变纯合型样本，只有突变型探针产生荧光信号，而野生型探针没有产生荧光信号，说明野生型探针对突变型模板不会产生非特异性扩增；对于突变杂合型样本，突变型探针和野生型探针都产生了荧光信号。

有益效果：本发明能够快速的同时检测CYP2C9*2、CYP2C9*3和VKORC1-1639G>A 基因位点的多态性，具有极高的灵敏度和特异性；采用锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法(LNA-RMA法)，反应可以在37～42℃进行，对仪器设备的要求不高，操作简单，在30min 内即可得到结果；整个反应过程采用全封闭形式，避免了交叉污染的可能；扩增反应试剂采用冻干工艺，提高试剂稳定性，降低运输成本；用锁核酸修饰探针能够提高单碱基突变的检测特异性，比传统的DNA探针有更高的灵敏度，适用于基因分型检测。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1CYP2C9*2野生纯合型样本检测结果；

图2CYP2C9*2突变纯合型样本检测结果；

图3CYP2C9*2突变杂合型样本检测结果；

图4CYP2C9*3野生纯合型样本检测结果；

图5CYP2C9*3突变纯合型样本检测结果；

图6CYP2C9*3突变杂合型样本检测结果；

图7VKORC1-1639G>A野生纯合型样本检测结果；

图8VKORC1-1639G>A突变纯合型样本检测结果；

图9VKORC1-1639G>A突变杂合型样本检测结果。

具体实施方式

为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施方式作进一步地详细描述。

实施例1

1、引物和探针的设计

基于CYP2C9*2、CYP2C9*3和VKORC1-1639G>A基因突变序列或其互补序列设计的LNA-RMA检测引物和探针如下表1所示；

表1 CYP2C9和VKORC1基因引物与探针序列

注：LNA修饰的突变位点碱基用斜体加粗加下划线表示；CYP2C9*2和VKORC1 -1639G>A的野生型探针的荧光基团都用FAM修饰；CYP2C9*2和VKORC1-1639G>A的突变型探针的荧光基团都用ROX修饰；CYP2C9*2和VKORC1-1639G>A的野生型探针和突变型探针的淬灭基团都用BHQ修饰；CYP2C9*3的野生型探针的荧光基团都用TET修饰； CYP2C9*3的突变型探针的荧光基团都用CY5修饰；CYP2C9*3的野生型探针和突变型探针淬灭基团都用BHQ修饰。

2、样本的提取

采用血液基因组DNA提取试剂盒提取待测样本的DNA作为模板；

3、RMA反应体系的建立

将42.5μL缓冲液和5μL提取的待测样本DNA加入到含有扩增反应试剂A的检测管中，混匀，并向检测管中加入2.5μL的280mM醋酸镁溶液并混匀；将42.5μL缓冲液和5μL提取的待测样本DNA加入到含有含有扩增反应试剂B的检测管中，混匀，并向检测管中加入 2.5μL的280mM醋酸镁溶液并混匀；将两个检测管在实时恒温荧光检测器中39℃扩增20分钟；

其中，所述扩增反应试剂A包括CYP2C9*2上下游引物、CYP2C9*2野生型和突变型探针、CYP2C9*3上下游引物、CYP2C9*3野生型和突变型探针、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY 蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、 dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸；

所述扩增反应试剂B包括VKORC1-1639G>A上下游引物、VKORC1-1639G>A野生型和突变型探针、大肠杆菌RecA蛋白、、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸；

所述引物对及检测探针组在扩增体系中的终浓度分别为10μM；所述聚环氧乙烷的终浓度为10％w/v；所述海藻糖的终浓度为2mM；所述甘露醇的终浓度为2.5mM；所述ATP的终浓度为10mM；所述dNTPs的终浓度为2mM；所述肌酸激酶的终浓度为1000ng/mL；所述磷酸肌酸的终浓度为25mM；所述大肠杆菌RecA蛋白的终浓度为100ng/μL；所述UvsY蛋白的终浓度为40ng/μL；所述单链结合蛋白GP32的终浓度为800ng/μL；所述Bst聚合酶的终浓度为60ng/μL；所述核酸外切酶III的终浓度为80ng/μL；

所述阳性对照为CYP2C9*2野生型质粒和突变型质粒、CYP2C9*3野生型质粒和突变型质粒、VKORC1-1639G>A野生型质粒和突变型质粒；

所述阴性对照为无菌双蒸水；

4、检测结果判定：

通过实时恒温荧光检测器上显示的荧光信号判断所检测的CYP2C9*2、CYP2C9*3和VKORC1-1639G>A基因多态性位点。图1显示该样本为CYP2C9*2CC野生纯合型样本，仅野生型探针产生荧光信号，突变型探针无荧光信号；图2显示该样本为CYP2C9*2TT突变纯合型样本，仅突变型探针产生荧光信号，野生型探针无荧光信号；图3显示该样本为CYP2C9*2 CT突变杂合型样本，野生型探针和突变型探针都产生荧光信号；图4显示该样本为CYP2C9*3 AA野生纯合型样本，仅野生型探针产生荧光信号，突变型探针无荧光信号；图5显示该样本为CYP2C9*3CC突变纯合型样本，仅突变型探针产生荧光信号，野生型探针无荧光信号；图6显示该样本为CYP2C9*3AC突变杂合型样本，野生型探针和突变型探针都产生荧光信号；图7显示该样本为VKORC1-1639GG野生纯合型样本，仅野生型探针产生荧光信号，突变型探针无荧光信号；图8显示该样本为VKORC1-1639AA突变纯合型样本，仅突变型探针产生荧光信号，野生型探针无荧光信号；图9显示该样本为VKORC1-1639GA突变杂合型样本，野生型探针和突变型探针都产生荧光信号。

以上所述仅为本申请的较佳实施例，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

序列表

<110> 济南国益生物科技有限公司

<120> 一种基于锁核酸修饰的RMA法检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的试剂盒

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> CYP2C9*2基因(CYP2C9*2)

<400> 1

gatatgaagc agtgaaggaa gccctgattg at 32

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> CYP2C9*2基因(CYP2C9*2)

<400> 2

agtagtccag taaggtcagt gatatggagt agg 33

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> CYP2C9*2基因(CYP2C9*2)

<400> 3

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<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> CYP2C9*2基因(CYP2C9*2)

<400> 4

ttgggatggg gaagaggagc attgaggact gtgttcaaga ggaagc 46

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> CYP2C9*3基因(CYP2C9*3)

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caggaagaga ttgaacgtgt gattggcaga a 31

<210> 6

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<212> DNA

<213> CYP2C9*3基因(CYP2C9*3)

<400> 6

gcagtgtagg agaaacaaac ttaccttggg aat 33

<210> 7

<211> 50

<212> DNA

<213> CYP2C9*3基因(CYP2C9*3)

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agatgctgtg gtgcacgagg tccagagata cattgacctt ctccccacca 50

<210> 8

<211> 50

<212> DNA

<213> CYP2C9*3基因(CYP2C9*3)

<400> 8

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<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> VKORC1基因(VKORC1 -1639G>A)

<400> 9

gcaggagagg gaaatatcac agacgccaga g 31

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> VKORC1基因(VKORC1 -1639G>A)

<400> 10

gttctcgtgc ctcagcctcc caagtagttt 30

<210> 11

<211> 49

<212> DNA

<213> VKORC1基因(VKORC1 -1639G>A)

<400> 11

agagaagacc tgaaaaacaa ccattggccg ggtgcggtgg ctcacgcct 49

<210> 12

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<212> DNA

<213> VKORC1基因(VKORC1 -1639G>A)

<400> 12

gagaagacct gaaaaacaac cattggccag gtgcggtggc tcacccct 48